甜地丁中槲皮素的薄層鑒別和含量測定

楊修鎮(zhèn)

（山東省獸藥質(zhì)量檢驗所，濟(jì)南250022）

甜地丁為豆科植物米口袋Gueldenstaedtia verna（Georgi）A.Bor.的干燥全草，收載于《中華人民共和國獸藥典》二○一○年版二部，具有清熱解毒的功效［1］，臨床用于癰腫疔瘡，外耳道癤腫，闌尾炎的治療。甜地丁是獸用常用中藥材之一，原標(biāo)準(zhǔn)無薄層鑒別項和含量測定項，為了更好的控制本品質(zhì)量，本實驗對甜地丁中槲皮素的薄層鑒別和含量測定方法進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料 Agilent 1200高效液相色譜儀，槲皮素對照品，批號100081-200907，含量為96.5%，購自中國食品藥品檢定研究院。甜地丁飲片，批號20120411、20120523、20120618、20120622 購自涑玉平民大藥房，批號 20130311、20130415、20130518、20130524、20130617購自濟(jì)南建聯(lián)中藥店，批號20130722由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供。10批甜地丁飲片經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥系中藥鑒定專家李峰教授鑒定為豆科植物米口袋Gueldenstaedtia verna（Georgi）A.Bor.。硅膠G薄層板分別購自煙臺化學(xué)工業(yè)研究所、青島海洋化工分廠、德國Merck公司。甲醇為色譜純，流動相用水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 定性鑒別

1.2.1 對照品溶液制備 稱取槲皮素對照品1 mg加甲醇2 mL溶解，即得。

1.2.2 供試品溶液制備 取甜地丁飲片，粉碎，過三號篩，稱取2 g，加70%乙醇20 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加稀鹽酸10 mL使溶解，加熱回流30 min，放冷，用乙醚振搖提取3次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，即得。

1.2.3 薄層色譜方法 吸取槲皮素對照品溶液和供試品溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（7 ∶5 ∶0.5）［2］為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外燈（365 nm）下檢視。

1.3 含量測定

1.3.1 高效液相色譜條件［3］色譜柱為C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.3%磷酸溶液（50 ∶50），檢測波長為360 nm，流速1.0 mL／min，柱溫25℃，進(jìn)樣量 10 μL。

1.3.2 對照品溶液制備 精密稱取槲皮素對照品10 mg置100 mL量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得100 μg／mL的槲皮素對照品貯備液。精密量取上述槲皮素對照品貯備液5 mL，置25 mL量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得20 μg／mL的槲皮素對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液制備［4］取甜地丁飲片，粉碎，過三號篩，精密稱取2 g，置具篩錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2 h，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，精密加入25%鹽酸7 mL，置85℃ 水浴中水解30 min，取出，迅速放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.4 線性范圍考察［5］精密量取槲皮素對照品貯備液，用 80%甲醇稀釋成 5、10、20、40、80、100 μg／mL的系列溶液，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進(jìn)行測定，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)（x，μg／mL），進(jìn)行線性回歸分析。

1.3.5 精密度試驗

1.3.5.1 儀器精密度試驗 精密吸取20 μg／mL的槲皮素對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，在上述高效液相色譜條件下進(jìn)行測定。

1.3.5.2 重復(fù)性試驗 取同批甜地丁藥材粉末（過三號篩）約2 g，精密稱定，按1.3.3項下制備樣品溶液，制備6份，在上述高效液相色譜條件下分別進(jìn)行測定。

1.3.6 回收率試驗 精密稱取已知槲皮素含量的甜地丁飲片粉末（過三號篩）1 g，精密加入濃度為20 μg／mL 的槲皮素80%甲醇溶液 50 mL，自“稱定重量，加熱回流2 h”起按供試品溶液制備項制備樣品溶液，平行6份，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下分別進(jìn)行測定。

1.3.7 耐用性

1.3.7.1 供試品溶液的穩(wěn)定性 取同一供試品溶液，于制備后 0、1、2、4、8、16、24、48 h 注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下分別進(jìn)行測定。

1.3.7.2 色譜條件的微小變動 取同一供試品溶液，將流動相調(diào)整為甲醇-0.3%磷酸溶液（48 ∶52）、（52 ∶48）；柱溫的調(diào)整為22、28 ℃；流速調(diào)整為0.9、1.1 mL／min；檢測波長調(diào)整為358、362 nm，并更換不同廠家的同類型色譜柱分別進(jìn)行測定。

1.3.7.3 供試品溶液制備條件的微小變動 取同一批甜地丁飲片，將加熱回流時間調(diào)整為110、130 min，水解時間調(diào)整為 25、30 min，其余按供試品溶液制備項制備樣品溶液，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下分別進(jìn)行測定。

1.3.8 10 批樣品含量測定 取不同批號的甜地丁藥材，按1.3.3項下制備樣品溶液，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下分別進(jìn)行測定。

2 結(jié)果

2.1 定性鑒別 供試品色譜中，在對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，可實現(xiàn)有效分離，見圖1。

圖1 甜地丁中槲皮素的薄層鑒別照片

2.2 含量測定

2.2.1 色譜分離 在上述高效液相色譜條件下，分析得到對照品溶液、供試品溶液的色譜圖，從圖2、圖3可知，在所采用的色譜條件下，槲皮素可以得到很好的分離。

圖2 槲皮素對照品HPLC色譜圖

2.2.6 10批樣品含量測定 10批甜地丁飲片中槲皮素含量在0.51～1.23 mg／g之間，不同飲片含量差異較大。結(jié)果見表2。

圖3 甜地丁樣品HPLC圖譜

2.2.2 線性范圍考察 回歸方程為：y＝ 18.7190x+2.4276（r＝ 0.9997） 。 結(jié)果表明槲皮素進(jìn)樣濃度在5～100 μg／mL的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗

2.2.3.1 儀器精密度試驗 重復(fù)測定同一對照品溶液6次，峰面積RSD為0.3%，表明有儀器有良好的精密度。

2.2.3.2 重復(fù)性試驗 重復(fù)測定同一批甜地丁飲片6次，槲皮素含量 RSD為0.6%，表明重復(fù)性好。

2.2.4 回收率試驗 槲皮素平均回收率為96.1%，RSD為0.7%，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗

2.2.5 耐用性

2.2.5.1 供試品溶液的穩(wěn)定性 同一供試品溶液，于制備后 0、1、2、4、8、16、24、48 h 測定結(jié)果 RSD 為0.4%，表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5.2 色譜條件的微小變動 動相組成的微小波動：甲醇-0.3%磷酸溶液（48 ∶52）和（52 ∶48）；柱溫的微小變動（22、28℃）；流速的微小變動（0.9、1.1 mL／min）；檢測波長的微小變動（358、362 nm）以及采用不同廠家的同類型色譜柱對供試品溶液槲皮素的分離效果無明顯影響。

2.2.5.3 供試品溶液制備條件的微小變動 加熱回流時間的微小變動（110、130 min），水解時間的微小變動（25、30 min），同批甜地丁飲片槲皮素含量結(jié)果相對相差在1.5%以內(nèi)。

表2 10批樣品含量測定結(jié)果

3 討論與小結(jié)

本研究中采用3個廠家生產(chǎn)的硅膠G薄層板對薄層鑒別效果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明槲皮素均分離良好。但槲皮素專屬性較差，含有槲皮素的藥材種類較多，如能加快甜地丁對照藥材的研制，采用對照藥材進(jìn)行鑒別則能更好的控制藥材質(zhì)量。

本研究中供試品溶液制備項對甜地丁飲片的回流時間進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)回流時間為1 h，所測槲皮素含量值偏低，而回流時間為2 h和3 h則無明顯差異，故回流時間定為2 h。同時對精密加入25%鹽酸7 mL，置85℃ 水浴中水解的時間進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)水解時間為10 min，所測槲皮素含量值偏低，而水解時間為30 min和60 min則無明顯差異，故水解時間定為30 min。

目前尚無甜地丁中槲皮素含量測定的報道。本研究中所用的甜地丁飲片大多購自藥店，少量為大學(xué)學(xué)院提供，飲片受炮制加工、存儲等因素影響較大，要制訂含量限度尚需進(jìn)行大量研究。

［1］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○一○年版二部［S］.

［2］王曉飛，于 玲，杜華霜，等.三白草中槲皮素的薄層色譜鑒別［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2013，23（1）： 65-68.

［3］王 信.HPLC法測定虎杖葉中槲皮素的含量［J］.中藥材，2006，04（1）： 96-97.

［4］王祥培，許士娜，吳紅梅，等.天胡荽藥材中槲皮素的薄層鑒別與含量測定［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（1）： 44-45.

［5］高迎春，楊修鎮(zhèn)，魏秀麗，等.地錦草提取物制備工藝及質(zhì)量控制研究［J］.中國獸藥雜志，2010，44（6）： 23-26.