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    豬源沙門氏菌的分離與耐藥性分析

    2014-11-22 16:41:41狄文婷等
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年10期
    關(guān)鍵詞:大連沙門氏菌耐藥性

    狄文婷等

    摘要:采集遼寧省大連市各大農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場鮮豬肉68份,用選擇性培養(yǎng)基SS瓊脂培養(yǎng)基分離沙門氏菌,通過菌落形態(tài)及PCR方法對分離菌株進(jìn)行鑒定,利用肉湯微量稀釋法藥敏試驗(yàn)檢測沙門氏菌對9大類15種抗生素的耐藥性。結(jié)果表明:共獲得鮮豬肉樣品沙門氏菌12株,檢出率為17.6%;91.7%鮮豬肉樣品中的沙門氏菌至少耐受1種抗菌藥,耐藥率最高的抗生素為氟苯尼考(75.0%)、鹽酸沙拉沙星(66.7%)、硫酸新霉素(66.7%)和鹽酸多西環(huán)素(667%),其次為土霉素(58.3%)、硫酸慶大霉素(58.3%)、乙酰甲喹(58.3%),耐藥率較低的有乳酸環(huán)丙沙星(500%)、恩諾沙星(50.0%)、鹽酸環(huán)丙沙星(50.0%)、硫氰酸紅霉素(41.7%)、阿莫西林(16.7%)、硫酸黏菌素(16.7%);大連市農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場鮮豬肉的沙門氏菌檢出率較高,并且沙門氏菌對各類抗生素表現(xiàn)出了很高的耐藥性,這種高耐藥性也可能通過食物鏈傳遞給人類,應(yīng)該引起足夠重視。

    關(guān)鍵詞:豬肉;沙門氏菌;耐藥性;大連

    中圖分類號: R155.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號:1002-1302(2014)10-0278-02

    收稿日期:2013-11-07

    基金項(xiàng)目:大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(編號:S2013010);大連民族學(xué)院“太陽鳥項(xiàng)目”(編號:tyn13102)。

    作者簡介:狄文婷(1989—),女,黑龍江齊齊哈爾人,從事食品質(zhì)量與安全研究。E-mail:942859228@qq.com。

    通信作者:杜雄偉,博士,講師。E-mail:dxw@dlnu.edu.cn。沙門氏菌屬(Salmonella)是革蘭氏陰性、無芽孢、無莢膜、周身鞭毛、能運(yùn)動的需氧或兼性厭氧的短桿菌[1]。目前可以確定,除沙門氏菌活菌引起感染型中毒以外,沙門氏菌產(chǎn)生的腸毒素也是導(dǎo)致出現(xiàn)中毒癥狀的原因。沙門氏菌中毒主要是由動物性食品引起的,其中魚、乳、蛋也極易引發(fā)較嚴(yán)重的食源性疾病[2]。然而,隨著沙門氏菌被不斷研究和鑒定及其在養(yǎng)殖業(yè)中引發(fā)疾病,在養(yǎng)殖過程中為預(yù)防沙門氏菌引起的疾病,隨意給家禽、家畜投放抗菌藥,導(dǎo)致出現(xiàn)耐藥菌和多重耐藥現(xiàn)象,其耐藥譜也越來越廣。因此,通過耐藥性試驗(yàn)掌握沙門氏菌的耐藥譜,從而指導(dǎo)臨床醫(yī)學(xué)用藥,對食品安全具有重要意義。由于沙門氏菌及其耐藥性能夠在整個(gè)食物鏈傳遞,由食品傳遞到人,因此檢測鮮肉中的沙門氏菌,并且通過藥敏試驗(yàn)測定某種抗菌藥物對其抑菌濃度十分必要。近年來食源性沙門氏菌的鑒定檢測已經(jīng)在國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域得到重視和研究,馬國柱等[3-6]研究過陜西省、河南省的食源性沙門氏菌,其他相關(guān)研究未見報(bào)道[7]。本研究對遼寧省大連市豬源性沙門氏菌進(jìn)行分離,對9類15種抗生素進(jìn)行藥敏性分析,旨在為做好大連地區(qū)豬源性食品安全工作提供參考。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1菌株2012年10月至2013年9月采集大連市開發(fā)區(qū)金瑪、金發(fā)地等大型農(nóng)貿(mào)市場和超市的新鮮豬肉樣品68份,分離出可疑菌株12株。對照菌株為E.coil ATCC25922。

    1.1.2抗生素氯霉素類:Flo氟苯尼考(98.4%)。氨基糖苷類:Neo硫酸新霉素(696 U/mg),Gen硫酸慶大霉素(610 U/mg)。青霉素類:Amo阿莫西林(96.4%)。喹諾酮類:Nia煙酸諾氟沙星(99%),Sar鹽酸沙拉沙星(98%),CL乳酸環(huán)丙沙星(98.6%),Enr恩諾沙星(99.1%),CH鹽酸環(huán)丙沙星(98.8%)。大環(huán)內(nèi)酯類:Thi硫氰酸紅霉素(780 U/mg)。磺胺類:Sul磺胺間甲嘧啶鈉(99.2%)。多黏菌素:Col硫酸黏菌素(19 578 U/mg)。四環(huán)素類:Oxy土霉素(96.1%),Dox鹽酸多西環(huán)素(合多西環(huán)素92%)。人工合成的抗菌獸藥:Meq乙酰甲喹(99.1%)。

    1.2方法

    1.2.1采樣準(zhǔn)備工作:準(zhǔn)備封口膜若干,用乙醇棉擦拭內(nèi)部表面,達(dá)到殺菌效果;準(zhǔn)備營養(yǎng)肉湯和若干試管,將9 mL營養(yǎng)肉湯加到試管內(nèi),塞好,并在121 ℃條件下高壓滅菌 30 min。去市場上采樣時(shí)注意雜菌污染,每份樣品用1個(gè)封口膜裝好,并標(biāo)號做相應(yīng)記錄。每次采樣完成后,打開超凈工作臺的紫外燈滅菌30 min,然后將封口膜內(nèi)的肉樣品剪成 2~3 粒黃豆大小的肉粒放到滅菌后的營養(yǎng)肉湯試管里,最后將試管放到搖床里,36 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)18~24 h。

    1.2.2選擇性培養(yǎng)和增菌(1)準(zhǔn)備工作:在無菌操作臺內(nèi)進(jìn)行紫外滅菌30 min,將SS培養(yǎng)基以及培養(yǎng)皿(進(jìn)行包扎)在121 ℃條件下高壓滅菌30 min;之后在無菌操作臺上傾倒培養(yǎng)基并標(biāo)號;取出搖床上的試管,在無菌操作臺上分別對應(yīng)標(biāo)號劃線接種于SS培養(yǎng)基(現(xiàn)購),在(36±1) ℃下倒置培養(yǎng)18~24 h[8];將無菌操作臺進(jìn)行紫外滅菌30 min,將若干EP管、營養(yǎng)肉湯、移液槍頭以及牙簽包好,在121 ℃條件下高壓滅菌30 min。(2)一次增菌:在超凈臺內(nèi)用移液槍加1 mL營養(yǎng)肉湯于EP管內(nèi),取出恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)的培養(yǎng)皿,用接種針挑取單菌落接種到EP管內(nèi);然后用封口膜包好EP管,36 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)18~24 h。(3)二次增菌:一次增菌 18~24 h 后,在無菌操作臺里用移液槍加1 mL營養(yǎng)肉湯到新滅過菌的EP管,取出搖床里的EP管,用接種環(huán)接種到新EP管里;然后將舊EP管用封口膜包好,與30%~50%甘油按照3 ∶1比例混勻,在-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?;將新EP管用封口膜包好,36 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)18~24 h。

    1.2.3PCR試驗(yàn)準(zhǔn)備1盆冰塊。打開水浴鍋燒到100 ℃,將蒸餾水、移液槍頭在121 ℃條件下滅菌30 min,打開無菌操作臺紫外滅菌30 min。取出二次增菌的EP管,1 000 r/min 離心3 min。取出EP管,在超凈臺里倒出上清液,用移液槍吸取200 μL無菌水于EP管內(nèi),清洗2次。再加入200 μL無菌水。在水浴鍋內(nèi)煮10 min,然后在冰塊里冷卻5 min,最后在1萬r/min 條件下離心5 min.然后按照PCR試劑盒的要求按順序加樣,將處理好的樣品加好后放入PCR儀中,設(shè)定程序:94 ℃變性5 min;94 ℃變性,退火(不同引物溫度不同),72 ℃延伸,30~35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,最后16 ℃保存即可[9]。 PCR反應(yīng)完成后進(jìn)行電泳試驗(yàn)。凝膠板的制作:TAE×1 2 mL+瓊脂糖1 g+蒸餾水 98 mL,加熱使瓊脂糖完全融化;將液體倒入電泳槽,冷卻成型后即可。用10 μL樣品和2 μL Buffer進(jìn)行電泳試驗(yàn)點(diǎn)樣。點(diǎn)樣完成后,在U=400 V、I=95 mA、W=38、T=1 h的條件下進(jìn)行試驗(yàn)。電泳完成后在復(fù)紅染色液中浸泡30 min,在紫外燈光下觀察、照相、記錄[10]。結(jié)果沙門氏菌的條帶長度是286 bp。

    1.2.4藥敏試驗(yàn)將營養(yǎng)肉湯、試管、培養(yǎng)皿、移液槍頭在121 ℃、30 min條件下滅菌;96孔板用75%乙醇進(jìn)行殺菌,再在無菌操作臺上用紫外線殺菌30 min[11];所有藥品濃度均配制成5.12 g/L,-20 ℃保存于10 mL EP管中[12]。取1 mL藥品加入含9 mL營養(yǎng)肉湯的試管中,此時(shí)藥品濃度為512 mg/L。取20 μL菌液和約20 mL營養(yǎng)肉湯于培養(yǎng)皿中備用。96孔板中的所用孔都用移液排槍加100 μL營養(yǎng)肉湯,取100 μL的512 mg/L藥品加到96孔板第1排,攪勻,取第1排溶液100 μL加到第2排,以此類推,使最后所有孔均為100 μL。最后每孔加入100 μL菌液。此時(shí)第1排藥品濃度為128 mg/L,第2排藥品濃度為64 mg/L。以此類推,第3~12排藥品濃度分別為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/L。將96孔板放在36 ℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h,觀察結(jié)果。

    2結(jié)果與分析

    2.1鮮豬肉樣品沙門氏菌的分離鑒定結(jié)果

    本研究共獲得鮮豬肉樣品68份,分離12株沙門氏菌,分

    離率為17.6%。在大連市開發(fā)區(qū)農(nóng)副產(chǎn)品批發(fā)市場,沙門氏菌表現(xiàn)出了很高的污染率,其他時(shí)間在其他農(nóng)貿(mào)市場采集的樣品未出現(xiàn)被沙門氏菌污染情況。沙門氏菌是引發(fā)食源性疾病最常見的致病菌之一,本研究結(jié)果表明,應(yīng)對市場流通的鮮肉產(chǎn)品引起高度重視。本研究中分離樣品污染沙門氏菌的主要原因有2個(gè):其一,農(nóng)貿(mào)市場環(huán)境為沙門氏菌的生長創(chuàng)造了良好條件,未經(jīng)消毒而使用的工具污染鮮肉;其二,生豬在宰殺前已經(jīng)感染沙門氏菌。從68份市場豬肉中分離12株沙門氏菌,可見市場豬肉污染十分嚴(yán)重,應(yīng)該加強(qiáng)豬肉屠宰、運(yùn)輸、加工、貯存及銷售等環(huán)節(jié)的管理,防止病原菌污染。

    豬源沙門氏菌顯示了很高的耐藥性,至少可以耐受1種抗菌藥物,有的甚至可以耐受6~7種抗菌藥物,雖然耐藥率較低,但是沙門氏菌的多重耐藥已經(jīng)成為普遍現(xiàn)象。沙門氏菌的高耐藥性不止表現(xiàn)在食品、畜禽上,還會通過食物鏈傳遞到人類,使人產(chǎn)生對抗生素的耐藥性,從而加大對食源性疾病的治療難度,因此應(yīng)加強(qiáng)對食品和藥品的監(jiān)測。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Yang B W,Qu D,Zhang X L,et al. Prevalence and characterization of Salmonella serovars in retail meats of marketplace in Shaanxi,China[J]. International Journal of Food Microbiology,2010,141(1/2):63-72.

    [2]張華. 動物性產(chǎn)品中沙門氏菌的危害及控制措施[J]. 中國動物保健,2004(6):8-10.

    [3]馬國柱,王安禮,劉長宏,等. 2002年陜西省食品中食源性致病菌監(jiān)測[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志,2003,15(6):489-491.

    [4]張芳,馬國柱,潘立,等. 陜西省2002—2006年食源性致病菌污染狀況[J]. 中國公共衛(wèi)生,2008,24(2):222-224.

    [5]張秀麗,廖興廣,郝宗宇,等. 2006—2007年河南省生肉食品中沙門菌的主動監(jiān)測及其DNA指紋圖譜庫的建立[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2009,19(7):1545-1548.

    [6]楊保偉,曲東,申進(jìn)玲,等. 陜西食源性沙門氏菌耐藥及相關(guān)基因[J]. 微生物學(xué)報(bào),2010,50(6):788-796.

    [7]楊保偉,張秀麗,曲東,等. 2007—2008陜西部分零售畜禽肉沙門氏菌血清型和基因型[J]. 微生物學(xué)報(bào),2010,50(5):654-660.

    [8]劉華偉,馬立農(nóng),郭藹光,等. 畜禽及環(huán)境中沙門氏菌的PCR快速檢測與控制[J]. 家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2005,26(2):59-62.

    [9]劉渠,劉衡川,李灶平,等. 食品中沙門氏菌的耐藥性研究[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2004,31(3):330-332.

    [10]陳弟詩,郭萬柱,徐志文,等. 豬霍亂沙門氏菌的分離與鑒定以及PCR檢測方法的建立[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(20):6020-6023.

    [11]關(guān)文英,申志新,張淑紅,等. 河北省食品中沙門氏菌的耐藥性研究[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2006,33(10):1761-1763.

    [12]王娟,曲志娜,趙思俊,等. 禽源大腸桿菌和沙門氏菌耐藥性研究[J]. 中國動物檢疫,2009,26(5):64-65.

    1.2.4藥敏試驗(yàn)將營養(yǎng)肉湯、試管、培養(yǎng)皿、移液槍頭在121 ℃、30 min條件下滅菌;96孔板用75%乙醇進(jìn)行殺菌,再在無菌操作臺上用紫外線殺菌30 min[11];所有藥品濃度均配制成5.12 g/L,-20 ℃保存于10 mL EP管中[12]。取1 mL藥品加入含9 mL營養(yǎng)肉湯的試管中,此時(shí)藥品濃度為512 mg/L。取20 μL菌液和約20 mL營養(yǎng)肉湯于培養(yǎng)皿中備用。96孔板中的所用孔都用移液排槍加100 μL營養(yǎng)肉湯,取100 μL的512 mg/L藥品加到96孔板第1排,攪勻,取第1排溶液100 μL加到第2排,以此類推,使最后所有孔均為100 μL。最后每孔加入100 μL菌液。此時(shí)第1排藥品濃度為128 mg/L,第2排藥品濃度為64 mg/L。以此類推,第3~12排藥品濃度分別為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/L。將96孔板放在36 ℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h,觀察結(jié)果。

    2結(jié)果與分析

    2.1鮮豬肉樣品沙門氏菌的分離鑒定結(jié)果

    本研究共獲得鮮豬肉樣品68份,分離12株沙門氏菌,分

    離率為17.6%。在大連市開發(fā)區(qū)農(nóng)副產(chǎn)品批發(fā)市場,沙門氏菌表現(xiàn)出了很高的污染率,其他時(shí)間在其他農(nóng)貿(mào)市場采集的樣品未出現(xiàn)被沙門氏菌污染情況。沙門氏菌是引發(fā)食源性疾病最常見的致病菌之一,本研究結(jié)果表明,應(yīng)對市場流通的鮮肉產(chǎn)品引起高度重視。本研究中分離樣品污染沙門氏菌的主要原因有2個(gè):其一,農(nóng)貿(mào)市場環(huán)境為沙門氏菌的生長創(chuàng)造了良好條件,未經(jīng)消毒而使用的工具污染鮮肉;其二,生豬在宰殺前已經(jīng)感染沙門氏菌。從68份市場豬肉中分離12株沙門氏菌,可見市場豬肉污染十分嚴(yán)重,應(yīng)該加強(qiáng)豬肉屠宰、運(yùn)輸、加工、貯存及銷售等環(huán)節(jié)的管理,防止病原菌污染。

    豬源沙門氏菌顯示了很高的耐藥性,至少可以耐受1種抗菌藥物,有的甚至可以耐受6~7種抗菌藥物,雖然耐藥率較低,但是沙門氏菌的多重耐藥已經(jīng)成為普遍現(xiàn)象。沙門氏菌的高耐藥性不止表現(xiàn)在食品、畜禽上,還會通過食物鏈傳遞到人類,使人產(chǎn)生對抗生素的耐藥性,從而加大對食源性疾病的治療難度,因此應(yīng)加強(qiáng)對食品和藥品的監(jiān)測。

    參考文獻(xiàn):

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    [5]張秀麗,廖興廣,郝宗宇,等. 2006—2007年河南省生肉食品中沙門菌的主動監(jiān)測及其DNA指紋圖譜庫的建立[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2009,19(7):1545-1548.

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    [7]楊保偉,張秀麗,曲東,等. 2007—2008陜西部分零售畜禽肉沙門氏菌血清型和基因型[J]. 微生物學(xué)報(bào),2010,50(5):654-660.

    [8]劉華偉,馬立農(nóng),郭藹光,等. 畜禽及環(huán)境中沙門氏菌的PCR快速檢測與控制[J]. 家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2005,26(2):59-62.

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    [10]陳弟詩,郭萬柱,徐志文,等. 豬霍亂沙門氏菌的分離與鑒定以及PCR檢測方法的建立[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(20):6020-6023.

    [11]關(guān)文英,申志新,張淑紅,等. 河北省食品中沙門氏菌的耐藥性研究[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2006,33(10):1761-1763.

    [12]王娟,曲志娜,趙思俊,等. 禽源大腸桿菌和沙門氏菌耐藥性研究[J]. 中國動物檢疫,2009,26(5):64-65.

    1.2.4藥敏試驗(yàn)將營養(yǎng)肉湯、試管、培養(yǎng)皿、移液槍頭在121 ℃、30 min條件下滅菌;96孔板用75%乙醇進(jìn)行殺菌,再在無菌操作臺上用紫外線殺菌30 min[11];所有藥品濃度均配制成5.12 g/L,-20 ℃保存于10 mL EP管中[12]。取1 mL藥品加入含9 mL營養(yǎng)肉湯的試管中,此時(shí)藥品濃度為512 mg/L。取20 μL菌液和約20 mL營養(yǎng)肉湯于培養(yǎng)皿中備用。96孔板中的所用孔都用移液排槍加100 μL營養(yǎng)肉湯,取100 μL的512 mg/L藥品加到96孔板第1排,攪勻,取第1排溶液100 μL加到第2排,以此類推,使最后所有孔均為100 μL。最后每孔加入100 μL菌液。此時(shí)第1排藥品濃度為128 mg/L,第2排藥品濃度為64 mg/L。以此類推,第3~12排藥品濃度分別為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/L。將96孔板放在36 ℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h,觀察結(jié)果。

    2結(jié)果與分析

    2.1鮮豬肉樣品沙門氏菌的分離鑒定結(jié)果

    本研究共獲得鮮豬肉樣品68份,分離12株沙門氏菌,分

    離率為17.6%。在大連市開發(fā)區(qū)農(nóng)副產(chǎn)品批發(fā)市場,沙門氏菌表現(xiàn)出了很高的污染率,其他時(shí)間在其他農(nóng)貿(mào)市場采集的樣品未出現(xiàn)被沙門氏菌污染情況。沙門氏菌是引發(fā)食源性疾病最常見的致病菌之一,本研究結(jié)果表明,應(yīng)對市場流通的鮮肉產(chǎn)品引起高度重視。本研究中分離樣品污染沙門氏菌的主要原因有2個(gè):其一,農(nóng)貿(mào)市場環(huán)境為沙門氏菌的生長創(chuàng)造了良好條件,未經(jīng)消毒而使用的工具污染鮮肉;其二,生豬在宰殺前已經(jīng)感染沙門氏菌。從68份市場豬肉中分離12株沙門氏菌,可見市場豬肉污染十分嚴(yán)重,應(yīng)該加強(qiáng)豬肉屠宰、運(yùn)輸、加工、貯存及銷售等環(huán)節(jié)的管理,防止病原菌污染。

    豬源沙門氏菌顯示了很高的耐藥性,至少可以耐受1種抗菌藥物,有的甚至可以耐受6~7種抗菌藥物,雖然耐藥率較低,但是沙門氏菌的多重耐藥已經(jīng)成為普遍現(xiàn)象。沙門氏菌的高耐藥性不止表現(xiàn)在食品、畜禽上,還會通過食物鏈傳遞到人類,使人產(chǎn)生對抗生素的耐藥性,從而加大對食源性疾病的治療難度,因此應(yīng)加強(qiáng)對食品和藥品的監(jiān)測。

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