蘋果M7砧木組織培養(yǎng)與抗性篩選

段艷欣

摘要：以M7組培苗為試驗(yàn)材料，進(jìn)行繼代擴(kuò)繁和卡那霉素抗性篩選研究。結(jié)果表明，M7芽苗在MS+4.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA（3%蔗糖）固體培養(yǎng)基中繼代時(shí)，出現(xiàn)嚴(yán)重的玻璃化，而MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（3%蔗糖）固體培養(yǎng)基可大大改善其玻璃化程度，使其恢復(fù)健康生長(zhǎng)；卡那霉素對(duì)M7葉片再生、新梢增殖、新梢生根均有抑制作用，并且隨卡那霉素濃度增加，M7葉片再生率、新梢增殖率、新梢生根率不斷下降；M7葉片愈傷組織形成、愈傷組織生根、新梢增殖及新梢生根對(duì)卡那霉素的敏感濃度分別為20、5、40、10 mg/L。

關(guān)鍵詞：蘋果M7砧木；組織培養(yǎng)；玻璃化；抗性篩選

中圖分類號(hào)： S661.104.+3；Q813.1+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）10-0052-02

蘋果（Malus pumila Mill）M7是薔薇科蘋果屬植物，為蘋果的半矮化砧木，與蘋果嫁接親和力強(qiáng)，其根系發(fā)達(dá)，較抗旱、抗寒，耐瘠薄，適應(yīng)性很強(qiáng)。轉(zhuǎn)基因安全性一直是人們關(guān)心的熱點(diǎn)，而對(duì)蘋果砧木的遺傳改良比對(duì)品種的改良更具有可操作性。卡那霉素抗性基因即新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（nptⅡ）是目前在植物基因轉(zhuǎn)化中應(yīng)用最廣泛的選擇標(biāo)記基因[1]。前人研究表明，不同外植體或同一外植體不同發(fā)育階段對(duì)卡那霉素的敏感性不一樣[2]，因此在進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化之前，首先要確定外植體對(duì)卡那霉素的敏感性濃度[3]。本試驗(yàn)以蘋果M7砧木組培苗為試驗(yàn)材料，研究其在繼代擴(kuò)繁過程中的生長(zhǎng)情況，并分別在葉片再生、新梢增殖、生根等方面進(jìn)行了卡那霉素敏感試驗(yàn)，以期為后期的遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

以蘋果M7砧木組培苗為試驗(yàn)材料，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存，選取生長(zhǎng)健壯、帶2～3張葉的芽為外植體。試驗(yàn)用卡那霉素為醫(yī)藥級(jí)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其他試劑為分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1M7苗的繼代增殖培養(yǎng)選取生長(zhǎng)健壯的M7組培苗，接種在繼代增殖培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基配方為：MS+4.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA，每瓶接4個(gè)新芽，每個(gè)處理接5瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)芽的增殖與生長(zhǎng)情況。在使用上述增殖培養(yǎng)基繼代時(shí)，發(fā)現(xiàn)大部分芽出現(xiàn)玻璃化，將玻璃化的芽單獨(dú)切下，改用MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基培養(yǎng)，15 d后觀察芽苗的生長(zhǎng)情況。

1.2.2M7葉片再生過程對(duì)卡那霉素的敏感性選取組培苗頂部幼嫩、生長(zhǎng)健壯、平展的葉片，葉片大小、形狀和色澤基本一致，將葉片用接種刀橫切幾刀，葉背朝上平鋪在加有不同濃度（0、5、10、20 mg/L）卡那霉素的葉片再生培養(yǎng)基上[4]，培養(yǎng)基配方為：MS+4.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA，暗培養(yǎng)14 d后轉(zhuǎn)移至光照下培養(yǎng)20 d后，觀察葉片長(zhǎng)愈傷組織或長(zhǎng)芽情況。接種量10張葉片/皿，3皿/處理，2次重復(fù)。

1.2.3M7新梢增殖對(duì)卡那霉素的敏感性試驗(yàn)將長(zhǎng)度約 2 cm 的組培芽（新梢）分別接種于加有不同濃度（0、10、20、40 mg/L）卡那霉素的新梢擴(kuò)繁培養(yǎng)基（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA）中，于光照下培養(yǎng)1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。接種量4個(gè)芽/瓶，5瓶/處理，重復(fù)2次。

1.2.4M7新梢生根對(duì)卡那霉素的敏感性試驗(yàn)將長(zhǎng)度約 2 cm （帶有2～3張葉）的組培芽（新梢）分別接種于加有不同濃度（0、5、10、20 mg/L）卡那霉素生根培養(yǎng)基中（1/2MS+1.0 mg/L IBA），于光照下培養(yǎng)20～30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。接種量3個(gè)芽/瓶，4瓶/處理，重復(fù)2次。

1.3培養(yǎng)條件

芽增殖與生根培養(yǎng)在光照培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行，培養(yǎng)條件為：溫度為（25±2） ℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照時(shí)間為12 h/d。葉片再生試驗(yàn)的暗培養(yǎng)是在恒溫箱中進(jìn)行的，培養(yǎng)溫度 24 ℃。培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖30 g/L、瓊脂8 g/L，pH值5.8，將配制好的培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌20 min備用。

2結(jié)果與分析

2.1M7組培苗的增殖與玻璃化苗的改善

取生長(zhǎng)健壯的M7組培苗，莖段部分帶3～4張嫩葉，轉(zhuǎn)移至繼代擴(kuò)繁培養(yǎng)基中（圖 1-A）；于光下培養(yǎng)20 d左右，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)出大量不定芽，培養(yǎng)30 d時(shí)，部分不定芽表現(xiàn)正常（圖1-B），部分不定芽的嫩莖、葉片呈半透明水漬狀（圖1-C），即玻璃化，此類芽生長(zhǎng)緩慢，繁殖系數(shù)低，不利于保存與再利用；改變培養(yǎng)基配方后，其玻璃化現(xiàn)象得到了較大改善，芽與葉片呈綠色，恢復(fù)生長(zhǎng)（圖1-D）。

2.2M7葉片再生過程對(duì)卡那霉素的敏感性

在M7葉片再生過程中，添加不同濃度卡那霉素后，葉片再生情況為：沒有添加卡那霉素的培養(yǎng)基葉片形成愈傷組織率高達(dá)100%，之后從愈傷組織處生根（圖2-A、圖2-B）；當(dāng)卡那霉素濃度為5 mg/L時(shí)，葉片出愈率為60%，愈傷組織

不能分化出根（圖2-C）；卡那霉素濃度升高至10 mg/L時(shí)的出愈率僅為10%，卡那霉素濃度為20 mg/L時(shí)，無愈傷組織形成（圖2-D），這2個(gè)濃度下均沒有根分化。

2.3M7新梢增殖對(duì)卡那霉素的敏感性

由表1可見，M7新梢芽增殖倍數(shù)隨卡那霉素濃度增大而減少直至無增殖甚至死亡?？敲顾貪舛葹? mg/L時(shí)，芽增殖率100%，并且芽生長(zhǎng)健壯，正常綠色；濃度為10 mg/L時(shí)，芽增殖倍數(shù)為2.5，比對(duì)照約下降68%，且再生芽黃綠色，生長(zhǎng)勢(shì)弱；濃度為20 mg/L時(shí)，芽增殖率下降到對(duì)照的5%左右，芽黃綠色，幾乎不生長(zhǎng)；當(dāng)卡那霉素濃度為40 mg/L，新梢沒有增殖，說明該濃度可以完全抑制M7新梢的增殖。

2.4M7新梢生根對(duì)卡那霉素敏感性

由表2看出，M7新梢生根數(shù)隨卡那霉素濃度的升高而明顯下降，且芽苗不斷變黃甚至白化死亡?？敲顾貪舛葹?0 mg/L時(shí)，芽苗生根率100%（圖3-A），平均每棵苗生根數(shù)為2～3條，并且根生長(zhǎng)粗壯，白色，生長(zhǎng)較快；卡那霉素濃度為5 mg/L時(shí)，生根率10%，根白色，生長(zhǎng)明顯減慢；卡那霉素濃度為10 mg/L時(shí)，新梢不能生根（圖3-B），可見 ≥10 mg/L 卡那霉素可以完全抑制M7芽苗的生根。

表1卡那霉素對(duì)M7新梢增殖的影響

卡那霉素濃度

（mg/L）接種芽數(shù)

（個(gè)）芽再生情況芽增殖倍數(shù)芽生長(zhǎng)狀況（健壯與否）0407.8綠色，健壯10402.5黃綠色，生長(zhǎng)較弱20400.4黃綠色，幾乎不生長(zhǎng)40400無

表2卡那霉素對(duì)M7新梢生根的影響

卡那霉素濃度

（mg/L）接種芽數(shù)

（個(gè)）生根數(shù)量

（條）根生長(zhǎng)情況01235白色，健壯，生長(zhǎng)較快5122白色，生長(zhǎng)較慢10120無20120無

3小結(jié)與討論

玻璃化現(xiàn)象是一種生理病態(tài)現(xiàn)象，也是蘋果莖尖培養(yǎng)時(shí)

經(jīng)常遇到的問題，發(fā)生玻璃化的材料呈半透明水漬狀，生長(zhǎng)緩慢、繁殖系數(shù)低，偶爾可在延長(zhǎng)培養(yǎng)期間恢復(fù)正常生長(zhǎng)，但通常比率很低。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因，張洪勝等認(rèn)為是培養(yǎng)環(huán)境中的某種脅迫條件誘導(dǎo)產(chǎn)生應(yīng)激乙烯，乙烯的直接或間接作用引起玻璃化的發(fā)生[5]；也有研究表明，改變培養(yǎng)時(shí)的濕度、瓊脂濃度、細(xì)胞分裂素濃度等均可有效地預(yù)防和緩解玻璃苗的發(fā)生[6]。本試驗(yàn)中，采用4.0 mg/L 6-BA與0.3 mg/L IBA組合，雖然可以誘導(dǎo)M7大量增殖，但容易導(dǎo)致玻璃化苗的產(chǎn)生，采用1.0 mg/L 6-BA與0.1 mg/L NAA組合可使玻

璃化芽苗恢復(fù)正常生長(zhǎng)。

卡那霉素是植物轉(zhuǎn)基因研究中最常用的篩選標(biāo)記，不同物種、基因型及外植體材料對(duì)卡那霉素的敏感性存在較大差異[7]。篩選用卡那霉素的最佳濃度是一方面可有效抑制非轉(zhuǎn)化組織的生長(zhǎng)，另一方面能使轉(zhuǎn)化組織正常發(fā)芽和生長(zhǎng)發(fā)育[8-9]。通過系統(tǒng)研究不同濃度卡那霉素對(duì)M7葉片再生、芽增殖及生根的影響，明確了適宜M7篩選用的最佳濃度。蘋果M7砧木葉片愈傷組織形成對(duì)卡那霉素的敏感濃度為 20 mg/L，抑制葉片愈傷組織生根的卡那霉素濃度為5 mg/L；M7新梢增殖與生根對(duì)卡那霉素的敏感濃度分別為40、10 mg/L。

參考文獻(xiàn)：

[1]程家勝，鄂超蘇，田穎川，等. 轉(zhuǎn)Bt抗蟲基因蘋果植株的再生[J]. 中國(guó)果樹，1994（4）：14-15.

[2]Duan Y X，Guo W W，Meng H J，et al. High efficient transgenic plant regeneration from embryogenic calluses of Citrus sinensis[J]. Biologia Plantarum，2007，51（2）：212-216.

[3]王紫萱，易自力. 卡那霉素在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用及其抗性基因的生物安全性評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)生物工程雜志，2003，23（6）：9-13.

[4]魏國(guó)芹，梁美霞，李鼎立，等. 平邑甜茶與M7離體葉片不定芽再生的研究[J]. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，26（2）：103-108.

[5]張洪勝，牟云官，辛培剛. 蘋果離體培養(yǎng)中試管苗玻璃化現(xiàn)象發(fā)生機(jī)理的探討[J]. 果樹科學(xué)，1991，8（2）：71-74.

[6]高遐虹，李梅，張桂鳳. 蘋果砧木試管苗發(fā)生玻璃化的因素及預(yù)防[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，12（2）：16-19.

[7]魏愛民，張文珠，杜勝利，等. 黃瓜花粉管通道法抗蟲基因?qū)爰翱敲顾乜剐院Y選[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（6）：54-57.

[8]王峰，盧永恩，李漢霞. 幾種白菜類蔬菜卡那霉素抗性的研究[J]. 武漢植物學(xué)研究，2006，24（4）：377-380.

[9]徐鵬飛，張淑珍，吳俊江，等. 利用卡那霉素對(duì)花粉管通道法轉(zhuǎn)基因大豆的篩選研究[J]. 大豆科學(xué)，2006（3）：275-278.

2.4M7新梢生根對(duì)卡那霉素敏感性

由表2看出，M7新梢生根數(shù)隨卡那霉素濃度的升高而明顯下降，且芽苗不斷變黃甚至白化死亡?？敲顾貪舛葹?0 mg/L時(shí)，芽苗生根率100%（圖3-A），平均每棵苗生根數(shù)為2～3條，并且根生長(zhǎng)粗壯，白色，生長(zhǎng)較快；卡那霉素濃度為5 mg/L時(shí)，生根率10%，根白色，生長(zhǎng)明顯減慢；卡那霉素濃度為10 mg/L時(shí)，新梢不能生根（圖3-B），可見 ≥10 mg/L 卡那霉素可以完全抑制M7芽苗的生根。

表1卡那霉素對(duì)M7新梢增殖的影響

卡那霉素濃度

（mg/L）接種芽數(shù)

（個(gè)）芽再生情況芽增殖倍數(shù)芽生長(zhǎng)狀況（健壯與否）0407.8綠色，健壯10402.5黃綠色，生長(zhǎng)較弱20400.4黃綠色，幾乎不生長(zhǎng)40400無

表2卡那霉素對(duì)M7新梢生根的影響

卡那霉素濃度

（mg/L）接種芽數(shù)

（個(gè)）生根數(shù)量

（條）根生長(zhǎng)情況01235白色，健壯，生長(zhǎng)較快5122白色，生長(zhǎng)較慢10120無20120無

3小結(jié)與討論

玻璃化現(xiàn)象是一種生理病態(tài)現(xiàn)象，也是蘋果莖尖培養(yǎng)時(shí)

經(jīng)常遇到的問題，發(fā)生玻璃化的材料呈半透明水漬狀，生長(zhǎng)緩慢、繁殖系數(shù)低，偶爾可在延長(zhǎng)培養(yǎng)期間恢復(fù)正常生長(zhǎng)，但通常比率很低。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因，張洪勝等認(rèn)為是培養(yǎng)環(huán)境中的某種脅迫條件誘導(dǎo)產(chǎn)生應(yīng)激乙烯，乙烯的直接或間接作用引起玻璃化的發(fā)生[5]；也有研究表明，改變培養(yǎng)時(shí)的濕度、瓊脂濃度、細(xì)胞分裂素濃度等均可有效地預(yù)防和緩解玻璃苗的發(fā)生[6]。本試驗(yàn)中，采用4.0 mg/L 6-BA與0.3 mg/L IBA組合，雖然可以誘導(dǎo)M7大量增殖，但容易導(dǎo)致玻璃化苗的產(chǎn)生，采用1.0 mg/L 6-BA與0.1 mg/L NAA組合可使玻

璃化芽苗恢復(fù)正常生長(zhǎng)。

卡那霉素是植物轉(zhuǎn)基因研究中最常用的篩選標(biāo)記，不同物種、基因型及外植體材料對(duì)卡那霉素的敏感性存在較大差異[7]。篩選用卡那霉素的最佳濃度是一方面可有效抑制非轉(zhuǎn)化組織的生長(zhǎng)，另一方面能使轉(zhuǎn)化組織正常發(fā)芽和生長(zhǎng)發(fā)育[8-9]。通過系統(tǒng)研究不同濃度卡那霉素對(duì)M7葉片再生、芽增殖及生根的影響，明確了適宜M7篩選用的最佳濃度。蘋果M7砧木葉片愈傷組織形成對(duì)卡那霉素的敏感濃度為 20 mg/L，抑制葉片愈傷組織生根的卡那霉素濃度為5 mg/L；M7新梢增殖與生根對(duì)卡那霉素的敏感濃度分別為40、10 mg/L。

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[3]王紫萱，易自力. 卡那霉素在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用及其抗性基因的生物安全性評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)生物工程雜志，2003，23（6）：9-13.

[4]魏國(guó)芹，梁美霞，李鼎立，等. 平邑甜茶與M7離體葉片不定芽再生的研究[J]. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，26（2）：103-108.

[5]張洪勝，牟云官，辛培剛. 蘋果離體培養(yǎng)中試管苗玻璃化現(xiàn)象發(fā)生機(jī)理的探討[J]. 果樹科學(xué)，1991，8（2）：71-74.

[6]高遐虹，李梅，張桂鳳. 蘋果砧木試管苗發(fā)生玻璃化的因素及預(yù)防[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，12（2）：16-19.

[7]魏愛民，張文珠，杜勝利，等. 黃瓜花粉管通道法抗蟲基因?qū)爰翱敲顾乜剐院Y選[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（6）：54-57.

[8]王峰，盧永恩，李漢霞. 幾種白菜類蔬菜卡那霉素抗性的研究[J]. 武漢植物學(xué)研究，2006，24（4）：377-380.

[9]徐鵬飛，張淑珍，吳俊江，等. 利用卡那霉素對(duì)花粉管通道法轉(zhuǎn)基因大豆的篩選研究[J]. 大豆科學(xué)，2006（3）：275-278.

2.4M7新梢生根對(duì)卡那霉素敏感性

由表2看出，M7新梢生根數(shù)隨卡那霉素濃度的升高而明顯下降，且芽苗不斷變黃甚至白化死亡?？敲顾貪舛葹?0 mg/L時(shí)，芽苗生根率100%（圖3-A），平均每棵苗生根數(shù)為2～3條，并且根生長(zhǎng)粗壯，白色，生長(zhǎng)較快；卡那霉素濃度為5 mg/L時(shí)，生根率10%，根白色，生長(zhǎng)明顯減慢；卡那霉素濃度為10 mg/L時(shí)，新梢不能生根（圖3-B），可見 ≥10 mg/L 卡那霉素可以完全抑制M7芽苗的生根。

表1卡那霉素對(duì)M7新梢增殖的影響

卡那霉素濃度

（mg/L）接種芽數(shù)

（個(gè)）芽再生情況芽增殖倍數(shù)芽生長(zhǎng)狀況（健壯與否）0407.8綠色，健壯10402.5黃綠色，生長(zhǎng)較弱20400.4黃綠色，幾乎不生長(zhǎng)40400無

表2卡那霉素對(duì)M7新梢生根的影響

卡那霉素濃度

（mg/L）接種芽數(shù)

（個(gè)）生根數(shù)量

（條）根生長(zhǎng)情況01235白色，健壯，生長(zhǎng)較快5122白色，生長(zhǎng)較慢10120無20120無

3小結(jié)與討論

玻璃化現(xiàn)象是一種生理病態(tài)現(xiàn)象，也是蘋果莖尖培養(yǎng)時(shí)

經(jīng)常遇到的問題，發(fā)生玻璃化的材料呈半透明水漬狀，生長(zhǎng)緩慢、繁殖系數(shù)低，偶爾可在延長(zhǎng)培養(yǎng)期間恢復(fù)正常生長(zhǎng)，但通常比率很低。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因，張洪勝等認(rèn)為是培養(yǎng)環(huán)境中的某種脅迫條件誘導(dǎo)產(chǎn)生應(yīng)激乙烯，乙烯的直接或間接作用引起玻璃化的發(fā)生[5]；也有研究表明，改變培養(yǎng)時(shí)的濕度、瓊脂濃度、細(xì)胞分裂素濃度等均可有效地預(yù)防和緩解玻璃苗的發(fā)生[6]。本試驗(yàn)中，采用4.0 mg/L 6-BA與0.3 mg/L IBA組合，雖然可以誘導(dǎo)M7大量增殖，但容易導(dǎo)致玻璃化苗的產(chǎn)生，采用1.0 mg/L 6-BA與0.1 mg/L NAA組合可使玻

璃化芽苗恢復(fù)正常生長(zhǎng)。

卡那霉素是植物轉(zhuǎn)基因研究中最常用的篩選標(biāo)記，不同物種、基因型及外植體材料對(duì)卡那霉素的敏感性存在較大差異[7]。篩選用卡那霉素的最佳濃度是一方面可有效抑制非轉(zhuǎn)化組織的生長(zhǎng)，另一方面能使轉(zhuǎn)化組織正常發(fā)芽和生長(zhǎng)發(fā)育[8-9]。通過系統(tǒng)研究不同濃度卡那霉素對(duì)M7葉片再生、芽增殖及生根的影響，明確了適宜M7篩選用的最佳濃度。蘋果M7砧木葉片愈傷組織形成對(duì)卡那霉素的敏感濃度為 20 mg/L，抑制葉片愈傷組織生根的卡那霉素濃度為5 mg/L；M7新梢增殖與生根對(duì)卡那霉素的敏感濃度分別為40、10 mg/L。

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[5]張洪勝，牟云官，辛培剛. 蘋果離體培養(yǎng)中試管苗玻璃化現(xiàn)象發(fā)生機(jī)理的探討[J]. 果樹科學(xué)，1991，8（2）：71-74.

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