玻璃化法及小液滴玻璃化法對香石竹莖尖超低溫保存效果的影響

林 田，楊 華，韓 靜，魏仕偉，李天菲

(上海市農業(yè)生物基因中心，上海 201106)

香石竹(DianthuscaryophyfllusL.)為石竹科石竹屬常綠亞灌木宿根花卉，是世界著名的四大切花之一，其栽培種及野生種資源的有效保存對香石竹的國產化至關重要。香石竹種質資源通常通過品種圃扦插及組織培養(yǎng)定期繼代保存，但香石竹一旦被病毒侵染，長期的無性繁殖易導致病毒在植物體內不斷積累，難以有效長期保存種質，需尋找更安全長效的保存方法。

超低溫保存是指液氮(-196 ℃)下的低溫保存。在此條件下，植物生命活動近乎停止，貯藏過程中的生理和遺傳變化能夠控制在最低限度內，具有資源保存的長期性和穩(wěn)定性優(yōu)點。此外，病毒在超低溫保存處理過程中會失活，因此可通過超低溫手段進行脫毒，這是營養(yǎng)繁殖植物種質資源長期保存的最優(yōu)選擇[1]。超低溫保存有多種方法，近年經常運用的以PVS2[2]作為冷凍保存液的玻璃化法，是將植物材料經高濃度的保護液處理后，迅速投入液氮中，使其組織中的水分轉變?yōu)椴ＡЩ癄顟B(tài)，從而避免形成冰晶造成機械損傷，達到有效保護植物的目的。玻璃化法已被運用于100多種植物不同組織的超低溫保存中。在常規(guī)玻璃化法上發(fā)展出來的小液滴玻璃化法，是將植物材料經玻璃化處理后，在鋁箔上滴成小液滴，然后直接投入液氮進行迅速冷凍。由于其凍存及解凍速度快，組織不易形成冰晶，并且易成活再生，因此是一種有發(fā)展前景的超低溫保存方法[3]。

國外關于香石竹的超低溫研究始于20世紀70年代，其成活率僅為2%[4]。Uemura等[5]將4～8 ℃馴化處理的香石竹莖尖通過慢凍法進行超低溫保存，成活率提高到 70%～80%。后通過兩步冷凍法及程序降溫法可使香石竹的成活率達90%[6-7]。隨著玻璃化試劑的發(fā)明，Langis等[8]于 1990年采用玻璃化法成功保存了香石竹莖尖。此后，在常規(guī)玻璃化方法上又發(fā)展出包埋玻璃化法及小液滴玻璃化法。Halmagyi等[9]將香石竹3個品種的莖尖用海藻酸鈉包埋玻璃化處理后進行凍存，成活率為60%～73%。筆者分別采用常規(guī)玻璃化法和小液滴玻璃化法對香石竹莖尖的超低溫保存技術進行探索，比較2種方法對超低溫保存效果的影響，為搭建球宿根花卉的超低溫保存技術平臺提供技術依據(jù)。

1 材料與方法

1.1莖尖準備供試材料主要為香石竹莖尖生長點。莖段誘導無菌苗在含6-BA1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+60 g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基上，在溫度為(25±2) ℃ 、光照強度2 000 lx、光暗周期16 h/8 h條件下培養(yǎng)，繼代30 d。解剖鏡下剝離切取2～3 mm、帶2片護葉的莖尖生長點(圖1)。

圖1 香石竹組培苗(右下角為剝取的莖尖)Fig.1 Plantlets of D.caryophyfllus (the lower right corner is the peeled shoot tips)

1.2常規(guī)玻璃化法凍存

1.2.1預培養(yǎng)。將莖尖接種到含0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基中，在10 ℃下培養(yǎng)1、3、5、7 d。

1.2.2裝載及玻璃化。將預培養(yǎng)后的材料在預處理溶液[10](含2 mol/L甘油及0.4 mol/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基)中室溫下處理30 min后，轉入玻璃化保護劑PVS2進行80 min的冰水浴處理。為得出最佳玻璃化時間，將在0.3 mol/L蔗糖濃度的MS培養(yǎng)基預培養(yǎng)5 d的莖尖分別進行15、30、60、80、120 min的玻璃化處理。

1.2.3凍存及解凍。將莖尖轉移至裝有預冷新鮮PVS2的2 mL冷凍管中(10莖尖/管)，迅速投入液氮中保存。取出在液氮中凍存1 h以上的冷凍管，立即放入40 ℃水浴中快速解凍2 min。莖尖在室溫下用含1.2 mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)液洗滌2～3次，每次5～10 min。

1.2.4恢復培養(yǎng)。將洗滌后的莖尖在濾紙上吸干后，轉移至含6-BA 0.5 mol/L，NAA 0.1 mol/L和GA30.5 mol/L的MS半固體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)，等莖尖返綠并有萌動跡象時再轉入MS固體培養(yǎng)基中常光培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同莖段誘導。定期觀察，記錄開始恢復生長的天數(shù)，20 d后計算成活率及再生率。已恢復生長(萌發(fā)根、芽或愈傷組織)的莖尖視為成活；莖尖直接分化而不形成愈傷為再生。試驗中每個處理20個莖尖，3次重復。

1.3小液滴玻璃化法凍存將“1.1”所得莖尖按“1.2”的優(yōu)化方案進行玻璃化處理。僅在凍存前5 min將含有1個莖尖的液滴(約5 μL)滴在5 mm×20 mm的無菌鋁箔條上(圖2)，再直接投入裝滿液氮的安培管中。解凍時直接將含液滴的鋁箔條投入洗滌液中解凍5～10 min，恢復培養(yǎng)同“1.2.4”。對照為常規(guī)玻璃化程序凍存后恢復培養(yǎng)的莖尖。

圖2 小液滴玻璃化法處理的香石竹莖尖Fig.2 Shoot-tips of D. caryophyfllus after droplet-vitrification treatment

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析試驗中每個處理20個莖尖，3次重復。成活率=成活莖尖數(shù)/處理莖尖數(shù)×100%；再生率=再生植株數(shù)/成活莖尖數(shù)×100%。試驗結果用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1預培養(yǎng)條件對成活率的影響由表1可知，在所設的4個蔗糖梯度下，凍存莖尖成活率隨預培養(yǎng)時間增加而上升，到5 d時達最高，預培養(yǎng)時間大于7 d時，成活率下降。預培養(yǎng)時間為1 d時，成活率隨蔗糖濃度增加而減少，莖尖切面滲出較多，其中0.7 mol/L的培養(yǎng)基中莖尖明顯變軟呈水漬狀，成活率僅為33.3%。較低蔗糖濃度下預培養(yǎng)3 d以上，莖尖傷口愈合，成活率隨蔗糖濃度增加而增加，但蔗糖濃度高于0.7 mol/L，預培養(yǎng)時莖尖易褐變及水漬化，成活率顯著下降(P<0.05)。在含0.5 mol/L蔗糖培養(yǎng)基上預培養(yǎng)5 d，可達最高成活率88.3%。

表1蔗糖預培養(yǎng)濃度及預培養(yǎng)天數(shù)對成活率的影響

Table1Effectofsugarconcentrationsinthepre-culturemediumandpre-culturetimeonsurvivalrate

%

2.2玻璃化時間對成活率的影響在對莖尖進行玻璃化處理時，處理時間小于15 min，由于保護劑處理時間過短，材料成活率僅為13.3%，隨玻璃化時間延長，成活率也上升，到80 min時可達86.7%，但隨時間延長成活率略有下降。120 min時，成活率仍可達72.5%(圖3)。凍后恢復培養(yǎng)莖尖在3～5 d內萌動，在5～15 d內直接長出新芽，個別莖尖形成愈傷組織。

圖3 PVS2處理時間對成活率的影響Fig.3 Effect of PVS2 treatment time on survival rate

2.3小液滴玻璃化法莖尖凍存效果與常規(guī)玻璃化方法凍存香石竹莖尖相比，小液滴玻璃化法在優(yōu)化玻璃化程序下進行凍存，成活率可達95.0%，顯著高于常規(guī)玻璃化法的成活率86.7%(P<0.05)。小液滴玻璃化法凍存恢復培養(yǎng)時，最快1 d即可見莖尖萌動，再生時間較常規(guī)玻璃化法要短3～5 d，成活植株全部再生，長勢較常規(guī)玻璃化法凍存再生植株強(表2，圖4)。

3 討論

3.1預培養(yǎng)對凍后成活率的影響莖尖的生理狀態(tài)對凍后成活率有著顯著影響。通過低溫馴化及短期高濃度蔗糖預培養(yǎng)，可使組織較緩和地脫去部分水分，同時促使細胞分泌保護物質，有利于凍后存活。香石竹植株4～8 ℃冷馴化后凍存，成活率可達70%～80%[11]。在薄荷[12]及蘋果[13]莖尖凍存中蔗糖預處理可顯著提高成活率。但滲透壓過大，易對植物組織造成傷害，需找到合適的濃度。在該試驗中以0.5 mol/L的蔗糖濃度培養(yǎng)基預培養(yǎng)成活率最高，而蔗糖濃度為0.7 mol/L時因高滲透壓對組織造成傷害，莖尖在預培養(yǎng)時易褐變及水漬化，成活率顯著下降。

表2凍存方式對成活率及植株再生的影響

Table2Effectofcryopreservationmethodonsurvivalrateandregenerationrate

圖4 常規(guī)玻璃化法(左)及小液滴玻璃化法(右)凍存恢復培養(yǎng)7 d后莖尖Fig.4 Shoot-tips cryopreserved by vitrification(left)and droplet-vitrification(right)recovered 7 d

此外，Bouman等[14]指出預培養(yǎng)一段時間除了提高抗凍性外，還促進切取過程中的傷口修復，提高成活。但如預培養(yǎng)時間過長，則不利于莖尖成活，如在石蒜[15]及百合[16]的超低溫保存中預培養(yǎng)時間超過7 d，莖尖褐變及生長點頂端閉合，成活率下降。在該試驗中，預培養(yǎng)1 d時成活率隨蔗糖濃度上升而下降，蔗糖濃度為0.7 mol/L時顯著下降，這可能與莖尖傷口在高濃度蔗糖下滲出較多、受傷害較大有關。而預培養(yǎng)3 d時，傷口修復，成活率上升；預培養(yǎng)5 d成活率最高；預培養(yǎng)大于7 d則因護葉閉合、褐變而引起成活率下降。

3.2玻璃化時間對成活率的影響玻璃化試劑可使組織脫去水分，這樣在凍存中可進入玻璃化狀態(tài)而不形成傷害性冰晶，有效地保護細胞。但由于試劑的高滲壓傷害及保護劑中DMSO使植物遺傳物質改變的潛在性，需嚴格把握玻璃化處理過程，使植物在達到一定成活率的同時，盡量減少暴露在玻璃化試劑中的時間[17]。在超低溫凍存中，不同植物所需玻璃化時間不同，菊花超低溫凍存中，玻璃化處理15 min可達到最高成活率[18]。而該試驗中玻璃化處理時間少于15 min，由于保護劑處理時間過短，材料脫水不夠，成活率僅為13.3%，隨時間延長成活率上升，到80 min時成活率最高，若延長至120 min時，仍可達較理想的效果，可見香石竹在較大時間范圍內進行玻璃化處理，成活率變動不大，這樣就使操作時間相對寬裕。

不同凍存方法所需玻璃化時間也不同，如在香石竹包埋玻璃化冷凍中，品種“Wanessa”在PVS2中處理200 min，可達到最高成活率[8]。相較而言，該試驗采用未經包埋的莖尖進行玻璃化凍存達到最高成活率只需80 min，這可能是因為海藻酸鈉包埋層在莖尖與玻璃化試劑中起緩沖作用，從而需更長的時間達到完全玻璃化。小液滴玻璃化法因凍存體積小，凍存解凍中容易玻璃化，故在保證一定成活率條件下，采用時間更少，從而減少處理過程中變異及受傷害的可能。

3.3凍存方式對成活率及植株再生的影響冷凍的方法因材料及超低溫冰凍方法不同可分為慢速冷凍及快速冷凍法。現(xiàn)在被廣泛使用的玻璃化法為快速冷凍，通常采用直接投入液氮以達到快速降溫，以躲過最易結冰的溫度區(qū)間-140～-10 ℃，使細胞內的水分還沒來得及形成冰晶，就到達了-196 ℃的安全區(qū)。解凍時在40 ℃左右的水浴中快速化凍，避免解凍過程中重結晶現(xiàn)象對細胞造成傷害。根據(jù)這個速凍速溶的原理發(fā)展出的小液滴玻璃化法，由于凍存體積小，冷凍及解凍速度遠高于常規(guī)玻璃化法，冰晶不易形成，恢復生長快，成活率高，目前已經成功應用于很多植物組織的超低溫保存[2]。較常規(guī)玻璃化法，小液滴玻璃化法可使香蕉的成活率提高40%～50%[19]。Halmagyi等[20]用程序降溫法、包埋脫水法、直接投入液氮的小液滴玻璃化法和玻璃化法等多種方法對菊花進行了超低溫保存，結果表明小液滴玻璃化法保存后得到了較高的成活率，這為植物的超低溫保存開辟了新途徑。香石竹的超低溫保存曾采用慢凍法、二步冷凍法、玻璃化法及包埋玻璃化法取得成功，筆者通過小液滴玻璃化法對香石竹莖尖進行成功保存，證明其是一種有潛力的超低溫保存方法，為搭建球宿根花卉的超低溫保存技術平臺提供了相關技術依據(jù)。

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