夏枯草中熊果酸含量的UPLC測定

謝文劍+曹藝+柏玉冰等

[摘要] 目的 建立夏枯草藥材中熊果酸含量的超高效液相色譜法（UPLC）測定方法。 方法 采用UPLC進行測定，色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以甲醇-0.5%冰乙酸水為流動相進行等度洗脫，流速為0.3 ml/min，柱溫30℃，檢測波長210 nm。 結(jié)果 熊果酸在0.2461～0.4922 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關系（r2=0.9999），平均回收率為99.29%，RSD=1.74%，熊果酸在夏枯草中的含量為0.28%～0.53%。 結(jié)論 該方法快速、高效、重現(xiàn)性好，可以為夏枯草藥材的質(zhì)量控制提供更有效的手段。

[關鍵詞] 夏枯草；熊果酸；超高效液相色譜法；含量測定

[中圖分類號] R927.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）10（a）-0011-03

夏枯草為唇形科植物夏枯草（Prunella vulgaris L.）的干燥成熟果穗，味辛、苦，性寒，具有清肝瀉火、明目、散結(jié)消腫之功效[1]。夏枯草的主要化學成分有三萜、黃酮、甾體、香豆素、蒽醌、苯丙素等[2]。其中的主要成分熊果酸具有鎮(zhèn)靜、抗?jié)?、降低血糖、抗炎、抗菌等多種生物學效應[3-5]。近年來，又發(fā)現(xiàn)熊果酸具有抑制癌細胞增長、轉(zhuǎn)移和誘導癌細胞凋亡等作用，極有可能成為一種新型抗癌藥物[6-8]。另外，熊果酸還具有明顯的抗氧化功能，被廣泛用作醫(yī)藥和化妝品原料[9]。

目前關于夏枯草藥材的質(zhì)量控制研究主要是以熊果酸、齊墩果酸和迷迭香酸等的HPLC含量測定和夏枯草藥材的HPLC指紋圖譜為主[10-14]，關于夏枯草超高效液相色譜法（UPLC）含量測定的研究還未有報道，且相比于傳統(tǒng)的HPLC而言，UPLC具有柱效高、分離度好和分離快等優(yōu)點，大大縮短了樣品運行的時間，可以滿足當下高通量分析的要求。因此，本實驗采用UPLC建立夏枯草藥材中熊果酸含量測定方法[15]，測定不同批次的夏枯草藥材中熊果酸的含量，該方法靈敏度高，分離度好，重現(xiàn)性好，可以為夏枯草藥材的質(zhì)量控制提供更有效的手段。

1 實驗材料

1.1 儀器

SK3300H型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司），T-214型電子分析天平（Denver公司），Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜系統(tǒng)、Empower工作站、四元梯度泵、自動進樣器、紫外檢測器（Waters 公司）。

1.2 試劑

甲醇（色譜純，Sigma公司），冰乙酸（色譜純，天津市化學試劑研究所），水為怡寶純凈水。對照品熊果酸為本課題組自制，純度>98%。

1.3 材料

15份夏枯草樣品均由廣州白云山星群（藥業(yè)）股份有限公司提供，經(jīng)中藥鑒定教研室龔力民老師鑒定為唇形科植物夏枯草。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以甲醇-0.5%冰乙酸水（80∶20）為流動相系統(tǒng)進行等度洗脫，檢測波長為210 nm，流速0.3 ml/min，柱溫30℃，進樣量1 μl。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取熊果酸對照品10.70 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇10 ml定容至刻度，密塞，搖勻，即得（每毫升對照品溶液含熊果酸1.07 mg）。

2.3 供試品溶液的制備

稱取夏枯草粉末約1.0 g，精密稱定，置于100 ml具塞錐形瓶中，加入甲醇10 ml，密塞超聲30 min，放冷至室溫，用甲醇補足重量，搖勻，0.22 μl微孔濾膜濾過，即得。

2.4 線性關系考察

精密吸取對照品溶液0.2、0.25、0.35、0.4、0.5 ml，分別置于1 ml容量瓶中，用甲醇定容，搖勻。分別取對照品溶液1 μl注入UPLC色譜儀，按上述色譜條件測定熊果酸峰面積積分值，以對照品峰面積積分值為縱坐標，對照品含量為橫坐標繪制標準曲線。計算熊果酸的回歸方程：Y=1.10×106X+6.93×104（r2=0.9997），線性范圍0.2461～0.4922 mg。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度實驗 取同一對照品溶液，重復進樣6次，進樣體積1 μl，按上述色譜條件測定熊果酸峰面積積分值，計算峰面積的RSD=1.47%，表明本方法精密度良好，符合方法學考察要求。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取同一對照品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，進樣體積1 μl，按上述色譜條件測定熊果酸峰面積積分值，計算24 h內(nèi)峰面積的RSD=1.62%，表明熊果酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復性試驗 取同一批夏枯草樣品6份，每份約1.0 g，精密稱定，按上述供試品溶液的制備方法制備。取1 μl注入UPLC色譜儀，在上述色譜條件下測定熊果酸峰面積積分值，計算熊果酸峰面積的RSD=1.54%，表明熊果酸重復性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗 取已知熊果酸含量的夏枯草粉末6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別加入熊果酸對照品適量，按上述供試品溶液制備方法制備。分別取樣品供試液1 μl注入UPLC色譜儀，測定熊果酸峰面積積分值，計算平均回收率為99.29%，RSD=1.74%，表明本方法加樣回收率良好（表1）。

2.6 含量測定

取不同批次的夏枯草樣品，每份約1.0 g，精密稱定，按上述供試品溶液制備方法制備。分別取樣品供試液1 μl注入UPLC色譜儀，測定熊果酸峰面積積分值，計算15份供試品溶液中熊果酸的含量（表2），對照品及樣品色譜圖見圖1。

3 討論

本實驗考察了甲醇、95%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇和50%乙醇6種不同提取溶劑，基于熊果酸峰面積確定了甲醇為提取溶劑。分別考察了10、15、20、25、30 ml五個體積，結(jié)果表明，提取溶劑體積為15 ml時，提取夏枯草樣品中熊果酸的效率最佳。比較超聲與回流兩種提取方法，超聲提取的效率要高于回流提取的提取率，故選擇超聲提取。分別考察不同超聲時間15、30、45、60 min，確定超聲時間為45 min。

對夏枯草中化學成分研究表明，其所含的三萜酸類成分主要為熊果酸和齊墩果酸。兩者為同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)極為相似，僅在C19和C20上有一個甲基位置的差異，給分離帶來一定難度，且熊果酸、齊墩果酸中無共軛體系，紫外吸收波長較短。在210 nm處，熊果酸的吸收峰靈敏度較高，其他色譜峰的干擾較小，分離最為理想，故選擇檢測波長為210 nm，測定熊果酸的含量。

不同產(chǎn)地夏枯草中熊果酸的含量存在的差別較大，這可能是由于不同采集地點生長環(huán)境的不同，藥材的生長年限、采收季節(jié)、原產(chǎn)地加工也均存在差異。因此，應注意有效成分含量的差別，嚴格規(guī)定夏枯草藥材的生長期、采收期，以保證臨床用藥的安全有效性。

本研究所建立的夏枯草中有效成分熊果酸的含量測定方法快速、準確，與傳統(tǒng)的HPLC測定方法相比，樣品的運行時間大大縮短，峰形與分離度均較好。

[參考文獻]

[1] 國家藥典委員會.中國藥典2010年版一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：263.

[2] 王祝舉，趙玉英，涂光忠，等.夏枯草化學成分的研究[J].藥學學報，1999，34（9）：679-681.

[3] Liu J.Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid[J].J Ethnopharmacol，1995，49（2）：57-68.

[4] Checker R，Sandur SK，Sharma D，et al.Potent anti-inflammatory activity of ursolic acid，a triterpenoid antioxidant，is mediated through suppression of NF-κB，AP-1 and NF-AT[J].PLoS One，2012，7（2）：e31318.

[5] Nascimento PGG，Lemos TLG，Bizerra A，et al.Antibacterial and antioxidant activities of ursolic acid and derivatives[J].Molecules，2014，19（1）：1317-1327.

[6] Kuttan G，Pratheeshkumar P，Manu KA，et al.Inhibition of tumor progression by naturally occurring terpenoids[J].Pharm Biol，2011，49（10）：995-1007.

[7] Shanmugam MK，Dai X，Kumar AP，et al.Ursolic acid in cancer prevention and treatment：molecular targets，pharmacokinetics and clinical studies[J].Biochem Pharmacol，2013，85（11）：1579-1587.

[8] Zang L，Wu B，Lin Y，et al.Research progress of ursolic acid′s anti-tumor actions[J].Chin J Integr Med，2014，20（4）：72-79.

[9] Santiago LA，Dayrit KC，Correa PCB，et al.Comparison of antioxidant and free radical scavenging activity of triterpenes α-amyrin，oleanolic acid and ursolic acid[J].J Nat Prod，2014.[Epub ahead of print]

[10] 許招懂，姚江雄，劉菊妍，等.夏枯草藥材 HPLC 指紋圖譜研究[J].中藥材，2012，35（8）：1234-1237.

[11] 秦雯，巴寅穎，張?zhí)m珍，等.不同產(chǎn)地夏枯草藥材HPLC特征圖譜[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（5）：1418-1420.

[12] 孫乙銘，徐建中，王志安，等.高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地的夏枯草中熊果酸含量[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（5）：1125-1126.

[13] 劉偉，丁海杰.HPLC測定夏枯草中熊果酸，齊墩果酸，迷迭香酸的含量[J].中成藥，2008，30（4）：577-580.

[14] 方羅，林能明，吳永江.高效液相色譜同時測定夏枯草藥材中4種活性成分的含量[J].中國中藥雜志，2010， 35（5）：616-619.

[15] 沈盼盼，謝曉梅，張圣龍，等.UPLC法測定宣木瓜中齊墩果酸、熊果酸[J].南京中醫(yī)藥大學學報，2013，29（3）：271-273.

（收稿日期：2014-07-11 本文編輯：林利利）

3 討論

本實驗考察了甲醇、95%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇和50%乙醇6種不同提取溶劑，基于熊果酸峰面積確定了甲醇為提取溶劑。分別考察了10、15、20、25、30 ml五個體積，結(jié)果表明，提取溶劑體積為15 ml時，提取夏枯草樣品中熊果酸的效率最佳。比較超聲與回流兩種提取方法，超聲提取的效率要高于回流提取的提取率，故選擇超聲提取。分別考察不同超聲時間15、30、45、60 min，確定超聲時間為45 min。

對夏枯草中化學成分研究表明，其所含的三萜酸類成分主要為熊果酸和齊墩果酸。兩者為同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)極為相似，僅在C19和C20上有一個甲基位置的差異，給分離帶來一定難度，且熊果酸、齊墩果酸中無共軛體系，紫外吸收波長較短。在210 nm處，熊果酸的吸收峰靈敏度較高，其他色譜峰的干擾較小，分離最為理想，故選擇檢測波長為210 nm，測定熊果酸的含量。

不同產(chǎn)地夏枯草中熊果酸的含量存在的差別較大，這可能是由于不同采集地點生長環(huán)境的不同，藥材的生長年限、采收季節(jié)、原產(chǎn)地加工也均存在差異。因此，應注意有效成分含量的差別，嚴格規(guī)定夏枯草藥材的生長期、采收期，以保證臨床用藥的安全有效性。

本研究所建立的夏枯草中有效成分熊果酸的含量測定方法快速、準確，與傳統(tǒng)的HPLC測定方法相比，樣品的運行時間大大縮短，峰形與分離度均較好。

[參考文獻]

[1] 國家藥典委員會.中國藥典2010年版一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：263.

[2] 王祝舉，趙玉英，涂光忠，等.夏枯草化學成分的研究[J].藥學學報，1999，34（9）：679-681.

[3] Liu J.Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid[J].J Ethnopharmacol，1995，49（2）：57-68.

[4] Checker R，Sandur SK，Sharma D，et al.Potent anti-inflammatory activity of ursolic acid，a triterpenoid antioxidant，is mediated through suppression of NF-κB，AP-1 and NF-AT[J].PLoS One，2012，7（2）：e31318.

[5] Nascimento PGG，Lemos TLG，Bizerra A，et al.Antibacterial and antioxidant activities of ursolic acid and derivatives[J].Molecules，2014，19（1）：1317-1327.

[6] Kuttan G，Pratheeshkumar P，Manu KA，et al.Inhibition of tumor progression by naturally occurring terpenoids[J].Pharm Biol，2011，49（10）：995-1007.

[7] Shanmugam MK，Dai X，Kumar AP，et al.Ursolic acid in cancer prevention and treatment：molecular targets，pharmacokinetics and clinical studies[J].Biochem Pharmacol，2013，85（11）：1579-1587.

[8] Zang L，Wu B，Lin Y，et al.Research progress of ursolic acid′s anti-tumor actions[J].Chin J Integr Med，2014，20（4）：72-79.

[9] Santiago LA，Dayrit KC，Correa PCB，et al.Comparison of antioxidant and free radical scavenging activity of triterpenes α-amyrin，oleanolic acid and ursolic acid[J].J Nat Prod，2014.[Epub ahead of print]

[10] 許招懂，姚江雄，劉菊妍，等.夏枯草藥材 HPLC 指紋圖譜研究[J].中藥材，2012，35（8）：1234-1237.

[11] 秦雯，巴寅穎，張?zhí)m珍，等.不同產(chǎn)地夏枯草藥材HPLC特征圖譜[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（5）：1418-1420.

[12] 孫乙銘，徐建中，王志安，等.高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地的夏枯草中熊果酸含量[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（5）：1125-1126.

[13] 劉偉，丁海杰.HPLC測定夏枯草中熊果酸，齊墩果酸，迷迭香酸的含量[J].中成藥，2008，30（4）：577-580.

[14] 方羅，林能明，吳永江.高效液相色譜同時測定夏枯草藥材中4種活性成分的含量[J].中國中藥雜志，2010， 35（5）：616-619.

[15] 沈盼盼，謝曉梅，張圣龍，等.UPLC法測定宣木瓜中齊墩果酸、熊果酸[J].南京中醫(yī)藥大學學報，2013，29（3）：271-273.

（收稿日期：2014-07-11 本文編輯：林利利）

3 討論

本實驗考察了甲醇、95%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇和50%乙醇6種不同提取溶劑，基于熊果酸峰面積確定了甲醇為提取溶劑。分別考察了10、15、20、25、30 ml五個體積，結(jié)果表明，提取溶劑體積為15 ml時，提取夏枯草樣品中熊果酸的效率最佳。比較超聲與回流兩種提取方法，超聲提取的效率要高于回流提取的提取率，故選擇超聲提取。分別考察不同超聲時間15、30、45、60 min，確定超聲時間為45 min。

對夏枯草中化學成分研究表明，其所含的三萜酸類成分主要為熊果酸和齊墩果酸。兩者為同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)極為相似，僅在C19和C20上有一個甲基位置的差異，給分離帶來一定難度，且熊果酸、齊墩果酸中無共軛體系，紫外吸收波長較短。在210 nm處，熊果酸的吸收峰靈敏度較高，其他色譜峰的干擾較小，分離最為理想，故選擇檢測波長為210 nm，測定熊果酸的含量。

不同產(chǎn)地夏枯草中熊果酸的含量存在的差別較大，這可能是由于不同采集地點生長環(huán)境的不同，藥材的生長年限、采收季節(jié)、原產(chǎn)地加工也均存在差異。因此，應注意有效成分含量的差別，嚴格規(guī)定夏枯草藥材的生長期、采收期，以保證臨床用藥的安全有效性。

本研究所建立的夏枯草中有效成分熊果酸的含量測定方法快速、準確，與傳統(tǒng)的HPLC測定方法相比，樣品的運行時間大大縮短，峰形與分離度均較好。

[參考文獻]

[1] 國家藥典委員會.中國藥典2010年版一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：263.

[2] 王祝舉，趙玉英，涂光忠，等.夏枯草化學成分的研究[J].藥學學報，1999，34（9）：679-681.

[3] Liu J.Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid[J].J Ethnopharmacol，1995，49（2）：57-68.

[4] Checker R，Sandur SK，Sharma D，et al.Potent anti-inflammatory activity of ursolic acid，a triterpenoid antioxidant，is mediated through suppression of NF-κB，AP-1 and NF-AT[J].PLoS One，2012，7（2）：e31318.

[5] Nascimento PGG，Lemos TLG，Bizerra A，et al.Antibacterial and antioxidant activities of ursolic acid and derivatives[J].Molecules，2014，19（1）：1317-1327.

[6] Kuttan G，Pratheeshkumar P，Manu KA，et al.Inhibition of tumor progression by naturally occurring terpenoids[J].Pharm Biol，2011，49（10）：995-1007.

[7] Shanmugam MK，Dai X，Kumar AP，et al.Ursolic acid in cancer prevention and treatment：molecular targets，pharmacokinetics and clinical studies[J].Biochem Pharmacol，2013，85（11）：1579-1587.

[8] Zang L，Wu B，Lin Y，et al.Research progress of ursolic acid′s anti-tumor actions[J].Chin J Integr Med，2014，20（4）：72-79.

[9] Santiago LA，Dayrit KC，Correa PCB，et al.Comparison of antioxidant and free radical scavenging activity of triterpenes α-amyrin，oleanolic acid and ursolic acid[J].J Nat Prod，2014.[Epub ahead of print]

[10] 許招懂，姚江雄，劉菊妍，等.夏枯草藥材 HPLC 指紋圖譜研究[J].中藥材，2012，35（8）：1234-1237.

[11] 秦雯，巴寅穎，張?zhí)m珍，等.不同產(chǎn)地夏枯草藥材HPLC特征圖譜[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（5）：1418-1420.

[12] 孫乙銘，徐建中，王志安，等.高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地的夏枯草中熊果酸含量[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（5）：1125-1126.

[13] 劉偉，丁海杰.HPLC測定夏枯草中熊果酸，齊墩果酸，迷迭香酸的含量[J].中成藥，2008，30（4）：577-580.

[14] 方羅，林能明，吳永江.高效液相色譜同時測定夏枯草藥材中4種活性成分的含量[J].中國中藥雜志，2010， 35（5）：616-619.

[15] 沈盼盼，謝曉梅，張圣龍，等.UPLC法測定宣木瓜中齊墩果酸、熊果酸[J].南京中醫(yī)藥大學學報，2013，29（3）：271-273.

（收稿日期：2014-07-11 本文編輯：林利利）