抑郁癥大鼠海馬體積異常的形態(tài)學(xué)探討

徐愛軍， 劉 昊， 劉 英， 李世英， 張 蕊， 王鳳玲， 王海濤

抑郁癥(depression)是一種情感性精神疾病，臨床表現(xiàn)以情緒低落為主要特征，嚴(yán)重時(shí)甚至伴隨幻覺妄想和自殺傾向。抑郁癥的嚴(yán)重性和危害性越來(lái)越受到重視，但其發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明。目前已經(jīng)證實(shí)，抑郁癥患者海馬容積存在明顯萎縮現(xiàn)象［1～4］。探討抑郁癥患者海馬萎縮的原因?qū)τ诮沂疽钟舭Y發(fā)病機(jī)制有重要意義。我們推測(cè)在抑郁癥發(fā)病過(guò)程中，海馬部位神經(jīng)元異常死亡，造成神經(jīng)元減少或丟失。為驗(yàn)證這一假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)建立抑郁癥大鼠模型，觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)改變，檢測(cè)神經(jīng)元凋亡和自噬的發(fā)生，為揭示抑郁癥海馬體積異常原因提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠40只，體重220～260 g(河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào):SCXK京2009-0004)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑藥品與儀器 LC-3兔多克隆抗體、Beclin 1羊多克隆抗體和β-actin鼠單克隆抗體(Santz Cruz，美國(guó));免疫印跡相關(guān)試劑(武漢博士德生物工程有限公司);蛋白電泳系統(tǒng)(北京六一);高靈敏度化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Bio-RAD，美國(guó))。

1.3 動(dòng)物分組和模型建立 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(20只)和模型組(20只)。對(duì)照組大鼠除每天抓取一次外不做特殊處理。模型組大鼠給予慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(CUMS)，建立抑郁模型。應(yīng)激包括11種:鼠籠45℃傾斜24 h，潮濕墊料24 h，行為限制3 h，4℃冰水游泳5 min，42℃熱水游泳5 min，禁食24 h，禁水 24 h，夾尾 1 min，鼠籠搖動(dòng) 15 min，持續(xù)光照36 h，雙耳電擊5 s(0.8 mA)。將上述11種應(yīng)激隨即分配到21 d內(nèi)，每日給予大鼠一種應(yīng)激，每種應(yīng)激平均出現(xiàn)2次，同種應(yīng)激不連續(xù)出現(xiàn)。

1.4 大鼠海馬尼氏染色 將兩組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛PBS緩沖液經(jīng)心臟灌流固定，分離腦組織，常規(guī)石蠟包埋，冠狀切片，片厚5μm。將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，尼氏染液室溫染色30 min。用蒸餾水沖洗3次，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹脂封片。光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡 將兩組大鼠各麻醉后斷頭取腦。根據(jù)圖譜，在立體顯微鏡下取右側(cè)海馬，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為5×105/ml-1×106/ml。取1 ml細(xì)胞，1000 r/min 4 ℃離心10 min，棄上清，加入1 ml預(yù)冷PBS，輕輕振蕩使細(xì)胞懸浮。重復(fù)操作3次，棄上清。將細(xì)胞重懸于200μl Binding Buffer液中，加入 10μl Annexin VFITC和5μl Propidium Iodide，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min。加入300μl Binding Buffer液，上機(jī)檢測(cè)。

1.6 Western blotting檢測(cè)海馬LC-3和Beclin-1 將兩組大鼠麻醉后斷頭取腦。根據(jù)圖譜，在體視顯微鏡下快速分離海馬，提取組織總蛋白。定量后按照30μg蛋白量上樣，進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，PVDF膜電轉(zhuǎn)印，脫脂奶粉封閉，一抗(LC-3，1:400;Beclin-1，1:400)4℃孵育過(guò)夜，二抗IgG(1:5000)室溫孵育1 h，ECL顯色。同樣方法進(jìn)行內(nèi)參照β-actin的Western blotting分析。以目的條帶與內(nèi)參照的光密度比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元形態(tài)改變 尼氏染色顯示對(duì)照組大鼠海馬錐體細(xì)胞層厚，細(xì)胞密度大，排列整齊、緊密，胞體飽滿，突起明顯。模型組大鼠海馬錐體細(xì)胞層變薄，細(xì)胞間隙大，排列疏松，體積明顯縮小，細(xì)胞核萎縮，突起減少(見圖1)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果 模型組和對(duì)照海馬神經(jīng)元組細(xì)胞凋亡率分別為17.14±2.71和3.34±0.80，模型組高于對(duì)照組(P ＜0.05)。

2.3 海馬組織LC-3和Beclin 1表達(dá) LC-3的表達(dá)呈現(xiàn)深淺不同的兩條條帶LC-3Ⅰ和LC-3Ⅱ。對(duì)免疫印跡圖像進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示模型組海馬LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ比值和Beclin 1相對(duì)表達(dá)均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表1、圖2)。

表1 兩組大鼠海馬LC-3和Beclin 1表達(dá)水平(n=5，χ±s)

圖1 大鼠海馬尼氏染色圖像(200×)。A:對(duì)照組;B:模型組

圖2 兩組大鼠海馬LC-3和Beclin 1的表達(dá)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)［5，6］，抑郁癥患者存在腦形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，以海馬和杏仁核等部位尤為明顯。海馬萎縮是抑郁癥的病理特征之一［7］。本實(shí)驗(yàn)采用尼氏染色和透射電子顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果表明模型組大鼠海馬錐體細(xì)胞層變薄，細(xì)胞間隙大，排列紊亂、疏松，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，甚至有細(xì)胞缺失，提示抑郁癥大鼠海馬部位存在明顯的神經(jīng)細(xì)胞死亡。細(xì)胞的死亡方式有程序性死亡和壞死，前者包括凋亡和自噬。創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙患者同樣存在海馬萎縮現(xiàn)象，其原因可能與海馬部位存在明顯的神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象有關(guān)［8，9］。

本研究建立應(yīng)激抑郁模型，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)元的凋亡情況。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬細(xì)胞凋亡率顯著增高。提示慢性應(yīng)激抑郁大鼠海馬存在明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。哺乳動(dòng)物的自噬相關(guān)基因有微管相關(guān)蛋白輕鏈-3(LC-3)和Beclin-1。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，存在兩種形式的LC-3，即LC-3Ⅰ和LC-3Ⅱ。其中，LC-3Ⅰ向LC-3Ⅱ轉(zhuǎn)化或者LC-3Ⅱ和LC-3Ⅰ的比例增大與自噬泡的形成數(shù)量相關(guān)，LC3-Ⅱ被認(rèn)為是自噬體的標(biāo)志分子［10］。Beclin-1參與自噬體的早期形成過(guò)程，是自噬重要的正調(diào)節(jié)因子。Yu等在成年大鼠大腦皮層、海馬等部位檢測(cè)到高表達(dá)的Beclin-1，提示這些部位細(xì)胞自噬活躍［11］。

本研究結(jié)果顯示，抑郁癥模型大鼠海馬自噬標(biāo)志分子LC-3Ⅱ比例增高，Beclin-1明顯上調(diào)。這均提示抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元存在明顯的細(xì)胞自噬。

自噬也被稱為Ⅱ型程序性死亡，是細(xì)胞通過(guò)單層或雙層膜包裹待降解物形成自噬體，運(yùn)送到溶酶體形成的自噬溶酶體并進(jìn)行多種酶的消化和降解，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和細(xì)胞器的更新。自噬對(duì)細(xì)胞起保護(hù)和引發(fā)死亡的雙重作用［12］。正常情況下，細(xì)胞自噬處在比較低的基礎(chǔ)水平。在輕度應(yīng)激時(shí)，自噬作為促生存機(jī)制，被適度激活以保護(hù)細(xì)胞免于凋亡和壞死;而在嚴(yán)重刺激時(shí)，自噬被過(guò)度激活引起細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展。本研究結(jié)果提示，抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元存在明顯的凋亡和自噬，這可能是導(dǎo)致海馬縮小的原因。凋亡和自噬二者關(guān)系復(fù)雜。海馬神經(jīng)細(xì)胞存在明顯的細(xì)胞凋亡和自噬，兩者在抑郁癥發(fā)病中的關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。

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