人ENO1基因的克隆及其重組逆病毒載體ENO1－pBABE－Puro 的構(gòu)建

李海紅 王秋香 王海琳 劉會(huì)玲 祝秉東 王千千 朱曉艷

近些年研究，ENO1基因在宮頸炎、CIN和宮頸癌中表達(dá)依次增強(qiáng)，經(jīng)紫杉醇聯(lián)合卡鉑新輔助化療后比較化療前后的蛋白表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)化療ENO1下調(diào)。這些提示ENO1可能參與了宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，可能會(huì)成為一個(gè)治療宮頸癌的分子靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建一個(gè)真核表達(dá)載體ENO1－pBABE－Puro為后期干擾宮頸癌細(xì)胞ENO1基因表達(dá)，以及表達(dá)后與化療藥物相關(guān)性研究及ENO1基因表達(dá)調(diào)控方式及作用做準(zhǔn)備，為研發(fā)宮頸癌抗腫瘤藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

E.coli DH 5α 大腸桿菌、pBABE－Puro質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存。人癌細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，Trizol購(gòu)自TAKARA公司，DEPC水、cDNA合成試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，DNA聚合酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，限制性?xún)?nèi)切酶salⅠ和BamHⅠ購(gòu)自Ferments公司，DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，小提質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。引物合成及基因測(cè)序由北京華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 人總RNA的提取及cDNA的合成 提取RNA前將所用材料用DEPC水浸泡過(guò)夜處理，100 ml的PBS加100 μl DEPC水?dāng)嚢杼幚?，目的是防止RNA酶的干擾。將長(zhǎng)滿整瓶的人癌細(xì)胞約1×106個(gè)細(xì)胞收集到離心管中，然后按照Trizol操作說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度;取提取的RNA 5 μl按cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于后續(xù)PCR的模版。

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù) GenBank中的烯醇化酶ENO1基因序列設(shè)計(jì)引物如下:上游5＇CGC GGA TCC ATG TCT ATT CTC AAG3＇，下游 5＇TGT CGA CTG CCC ACA GCT TAC TTG3＇。引物中含有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的序列，引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 目的基因的擴(kuò)增 以上述反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA為模版，應(yīng)用上述合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因ENO1。反應(yīng)體系為:cDNA模版1 μl，上游引物1 μl，下游引物 1 μl，5 × PCR Buffer 10 μl，dNTP 5 μl，ddH2O 31 μl，總體系為 50 μl。反應(yīng)條件是:95℃變性15 s，57℃退火 20 s，72℃延伸30 s，共 40 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。取100 μl PCR產(chǎn)物按照DNA純化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行 DNA純化。純化后用 salⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切后按照DNA膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行膠回收，然后測(cè)DNA密度。

1.2.4 pBABE－Puro 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的線性化 用salⅠ和BamHⅠ各自單酶切驗(yàn)證質(zhì)粒線性化后進(jìn)行雙酶切，雙酶切后按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)膠回收salⅠ和BamHⅠ雙酶切后的 pBABE－Puro質(zhì)粒，然后檢測(cè)DNA濃度。膠回收產(chǎn)物用于后期連接使用。

1.2.5 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的構(gòu)建 將膠回收后的ENO1目的基因和pBABE－Puro質(zhì)粒按分子量3∶1～5∶1的體系，用T4DNA連接酶在16℃水浴鍋中過(guò)夜連接。將連接好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH 5α大腸桿菌中，涂在含有氨芐抗生素的瓊脂LB固體培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取含有氨芐抗生素生長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆菌落，置于液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，提取質(zhì)粒。

1.2.6 重組載體的酶切鑒定及序列分析 將提取好的重組質(zhì)粒進(jìn)行salⅠ和BamHⅠ酶切初步鑒定。然后將帶有重組質(zhì)粒的菌液送北京華大基因公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增、克隆及鑒定

以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模版和上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成的引物進(jìn)行PCR基因克隆。1%瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，在約1 305 bp的位置出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期目的條帶一致，見(jiàn)圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖

2.2 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及鑒定

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH 5α大腸桿菌中，經(jīng)氨芐抗生素篩選陽(yáng)性克隆擴(kuò)增提取 ENO1－pBABE－Puro 重組質(zhì)粒，經(jīng) salⅠ和 BamHⅠ雙酶切鑒定。1%瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，ENO1－pBABE－Puro重組質(zhì)粒經(jīng)salⅠ和BamHⅠ雙酶切后出現(xiàn)兩條條帶，一條與PCR產(chǎn)物大小一致，一條與pBABEPuro質(zhì)粒一致。說(shuō)明ENO1已成功插入pBABE－Puro載體中，見(jiàn)圖2。

圖2 重組質(zhì)粒 ENO1－pBABE－Puro經(jīng)salⅠ和BamHⅠ雙酶切電泳圖

2.3 序列測(cè)定

將經(jīng)salⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定為陽(yáng)性的菌液送往北京華大基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank中公布的人ENO1基因序列完全一致，見(jiàn)圖3。

圖3 重組質(zhì)粒ENO1－pBABE－Puro部分測(cè)序圖

3 討論

德國(guó)生理學(xué)家Otto.Warburg早在1924年就提出了Warburg效應(yīng)的觀點(diǎn)，即惡性腫瘤細(xì)胞即使在氧氣充足的條件下，惡性腫瘤細(xì)胞仍有活躍的糖酵解代謝過(guò)程。Warburg效應(yīng)的提出，是糖酵解代謝過(guò)程一度成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。特別是近年認(rèn)為Warburg效應(yīng)是腫瘤的重要特征之一［1］，而且由于在臨床上正電子發(fā)射斷層顯影(PET)技術(shù)利用Warburg效應(yīng)來(lái)診斷、發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的應(yīng)用，使糖酵解代謝過(guò)程在腫瘤中的研究更受矚目。近些年研究探索，通過(guò)靶向糖代謝途徑中的一個(gè)或多個(gè)關(guān)鍵酶或其他分子來(lái)治療惡性腫瘤的策略備受關(guān)注。ENO1是糖酵解途徑的關(guān)健酶，它的基因的表達(dá)及在細(xì)胞中的定位對(duì)腫瘤的影響非常重要，因此對(duì)它的研究就顯得非常必要。

ENO1 又稱(chēng) α－烯醇化酶(α－enolase)、非神經(jīng)烯醇化 酶 (non－neural enolase)，基 因 位 于 1q36.3－1q 36.2［2］，此基因編碼 α 亞基，還有 2個(gè)烯醇化酶基因ENO2(enolase－2)、ENO3(enolase－3)分別編碼 γ、β 2個(gè)亞基。α、γ、β這3種亞基以非共價(jià)鍵結(jié)合形成αα、αβ、αγ、ββ、γγ 5種結(jié)構(gòu)形式，一般 αα 型即 ENO1 存在于絕大多數(shù)組織中;ββ 型即 β－烯醇化酶(β－enolase)幾乎只存在肌肉組織中;γγ型特異性存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，成為神經(jīng)母細(xì)胞瘤及具有神經(jīng)內(nèi)分泌作用的小細(xì)胞肺癌的腫瘤標(biāo)志物［3－4］。ENO1基因轉(zhuǎn)錄物含有2個(gè)編碼起始位點(diǎn)翻譯2種蛋白即37 ku 的蛋白 c－myc 啟動(dòng)子結(jié)合蛋白(c－myc promoter binding protein，MBP－1)和48 ku 的 ENO1。ENO1 含有433個(gè)氨基酸，這兩個(gè)相同的αα亞基每個(gè)亞基的相對(duì)分子量約47 000;鎂離子是維持ENO1二聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和最大活性的重要輔因子。

長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為ENO1是一個(gè)古老、保守、功能單一的蛋白，但最近十幾年的研究發(fā)現(xiàn)ENO1不僅只是一個(gè)糖酵解過(guò)程中的關(guān)健酶催化磷酸甘油酸向磷酸烯醇式丙酮酸的轉(zhuǎn)化，還是一個(gè)參與多種生理、病理過(guò)程的蛋白［5］，隨細(xì)胞的生理、病理、代謝和發(fā)育狀況的不同ENO1基因的表達(dá)有明顯差異。而且在細(xì)胞的胞核、胞質(zhì)及包膜中都有表達(dá)［6］。ENO1在細(xì)胞中不同位置的定位有相對(duì)主要的功能。主要定位于胞核中的是ENO1 基因編碼的 MBP－1［7］，它雖然不具有糖酵解酶的活性，但能與c－myc p2啟動(dòng)子結(jié)合，負(fù)向調(diào)控c－myc的表達(dá)［8］。原癌基因 c－myc是控制細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化的一個(gè)重要基因，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中c－myc基因產(chǎn)物表達(dá)異常促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生。Ghosh等［9］通過(guò)腺病毒將 MBP－1導(dǎo)入前列腺癌后，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。MBP－1可抑制胃癌細(xì)胞的增值［9］;Ejesk?r［10］將 ENO1 轉(zhuǎn)染 1q 缺失的成神經(jīng)細(xì)胞后，瘤細(xì)胞生長(zhǎng)明顯被抑制;Ghosh［11］、Chang 等［12］學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中ENO1表達(dá)普遍下調(diào)，且表達(dá)下調(diào)者預(yù)后差。這些研究證實(shí)定位于胞核的MBP－1具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，如宮頸癌、乳腺癌。但近年研究結(jié)果卻與之相反，主要因?yàn)槎ㄎ挥诎|(zhì)中ENO1是作為糖酵解的關(guān)健酶存在的，腫瘤細(xì)胞由于生長(zhǎng)速度快，血供相對(duì)不足，腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期處在缺氧的環(huán)境中，而且由于生長(zhǎng)過(guò)快，細(xì)胞合成、生長(zhǎng)所需能量增多。因此定位于胞質(zhì)中的ENO1在肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、乙肝病毒相關(guān)的肝癌、鼻咽癌、甲狀腺嗜酸細(xì)胞瘤和黑色素細(xì)胞瘤等腫瘤中表達(dá)增高［13－18］，且 ENO1與腫瘤的大小、分化程度、預(yù)后差有相關(guān)性。其在慢性宮頸炎、CIN和宮頸癌ENO1表達(dá)逐漸增強(qiáng)［19］。定位于細(xì)胞膜表面的ENO1起著纖溶酶原受體的作用，參與結(jié)合、活化、穩(wěn)定纖溶酶原以及腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［20－21］。而且細(xì)胞膜上表達(dá)的ENO1增高可以增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的侵潤(rùn)能力，提高穿透基質(zhì)的能力，還可能通過(guò)Notch信號(hào)通路控制c－myc癌蛋白的表達(dá)，參與腫瘤的形成過(guò)程［21］。有相關(guān)報(bào)道證實(shí)，細(xì)胞膜上的ENO1基因的表達(dá)與惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。

ENO1與宮頸癌的研究國(guó)內(nèi)外極少見(jiàn)，然而仍有相關(guān)報(bào)道提示，ENO1在宮頸癌中不僅在慢性宮頸炎、CIN、宮頸癌3組病變中ENO1蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，且ENO1的表達(dá)與患者年齡、腫瘤病理分級(jí)及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理學(xué)特征無(wú)明顯差異。但在腫瘤分化中，分化越低，核表達(dá)越少，其差異有顯著性。這提示在宮頸癌中分化越低，能調(diào)控抑制 c－myc蛋白的MBP－1可能減少了［19］?？梢?jiàn) ENO1基因的表達(dá)對(duì)宮頸癌有重要作用。但由于ENO1與宮頸癌相關(guān)性的研究國(guó)內(nèi)外極少見(jiàn)，因此在宮頸癌中腫瘤細(xì)胞是如何調(diào)控ENO1在細(xì)胞中的分布、作用使正常細(xì)胞胞核中多抑癌作用的MBP－1向腫瘤細(xì)胞胞核外的ENO1轉(zhuǎn)化，以及ENO1表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞化療的影響，有待進(jìn)一步研究。綜上所述，構(gòu)建一個(gè)含有ENO1基因的真核表達(dá)載體非常有必要。pBABE－Puro載體是來(lái)源于莫洛尼鼠類(lèi)白血病病毒，性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)細(xì)胞毒性小，能夠穩(wěn)定的表達(dá)外源目的基因及不影響其正常的功能，而且pBABE－Puro載體有很高的轉(zhuǎn)染效率，因此廣泛應(yīng)用于某些蛋白功能的研究。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)酶切初步鑒定及測(cè)序的最終鑒定證實(shí)，成功構(gòu)建了ENO1的真核表達(dá)載體ENO1－pBABE－Puro。為研究ENO1在腫瘤中作用和與宮頸癌細(xì)胞化療之間的相關(guān)性做好準(zhǔn)備。ENO1可能成為宮頸癌分子靶向治療的一個(gè)靶點(diǎn)。

［1］Hanahan D，Weinberg RA.Hallmarks of Cancer:The Next Generation〔J〕.Cell，2011，144(5):646－674.

［2］Onyango P，Lubyova B，gardellin P，et al.Molecular cloning and expression analysis of five novel genes in chromosome 1 p36〔J〕.Genomics，1998，50(2):187－198.

［3］Bogusz Trojanowicz，Cuong Hoang－Vu，Carsten Sekulla，etal.ENO1(Enolase 1，(alpha))〔J〕.Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol，2010，14(7):635－640.

［4］韓娜娜，孫長(zhǎng)崗，武 君.血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)在肺癌中的臨床價(jià)值〔J〕.實(shí)用癌癥雜志，2012，27(2):141－143.

［5］Pancholi V.Multifunctional alpha－enolase:its role in diseases〔J〕.Cell Mol Life Sci，2001，58(7):902－920.

［6］Sousa LP，Brasil BS，Silva Bde M，et al.Characterization of alpha－enolase as an interferon－alpha 2 alpha 1 regulated gene〔J〕.Front Biosci，2005，10:2534－2547.

［7］Wang W，Wang L，Endoh A，et al.Identification of alphaenolase as a nuclear DNA－binding protein in the zona fasciculate but not the zona reticularis of the human adrenal cortex〔J〕.J Endocrinol，2005，184(1):85－94.

［8］Hsu KW，Hsieh RH，Wu CW，et al.MBP－1 Suppresses G－rowth and metastasis of Gastric Cancer Cell through COX－2〔J〕.Mol Biol Cell，2009，20(24):5127－5137.

［9］Ghosh AK，Steele R，Ray RB.C－myc promoter－bingding protein1(MBP－1)regulates prostate cancer cell growth by inhibiting MAPK pathway〔J〕.J Bio Chem，2005，280(14):14325－14330.

［10］Ejesk?r K，Krona C，Carén H，et al.Introduction of in vitro transcribed ENO1 mRNA into neuroblastoma cells induces cell death〔J〕.BMC Cancer，2005，5:161.

［11］Ghosh A，Steele R，Ryerse J，et al.Tumor－suppressive effects of MBP－1 in non－small cell lung cancer cells〔J〕.Cancer Res，2006，66(24):11907－11912.

［12］Chang YS，Wu W，Walsh G，et al.Enolase－a is frequently down－regulated in non－small cell lung cancer and predicts aggressive biological behavior〔J〕.Clin Cancer Res，2003，9(10):3641－3644.

［13］Chang GC，Liu K J，Hsien CL，et al.Identification of alphaenolase as an antoantigen in lung cancer.Its overexpression is associated with clinical outcomes〔J〕.Clin Cancer Res，2006，12(19):5746－5754.

［14］張 瑩，李 敏，劉 宇，等.非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織和外周血血漿中ENO1蛋白水平分析〔J〕.中國(guó)肺癌雜志，2010，13(12):1089－1093.

［15］Baris O，Savagner F，Nasser V，et al.Transcriptional profiling revrals coordinated up－regulation of oxidative metabolism genes in thyroid oncocytic tumors〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2004，89(2):994－1005.

［16］SuzukiA，Iizuka A，Komiyama M，et al.Identification of melanoma antigens using a Serological Proteome Approach(SERPA)〔J〕.Cancer Genomics Proteomics，2010，7(1):17－23.

［17］Bai Z，Ye Y，Liang B，et al.Proteomics－based identification of a group of apoptosis－related proteins and biomarkers in gastric cancer〔J〕.International Journal of Oncology，2010，38(2):375－383.

［18］程 超，龍孝斌，李 欣，等.α－烯醇化酶在鼻咽癌中的表達(dá)〔J〕.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2011，25(12):554－556.

［19］趙時(shí)梅，羅殿中，黨裔武，等.α－enolase在宮頸癌中的表達(dá)及其意義〔J〕.右江名族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，33(6):749－752.

［20］Liu KJ，Shih NY.The role of enolase in tissue invasion and metastasis of pathogens and tumor cells〔J〕.J Cancer Mol，2007，3(2):45.

［21］Hsu KW，Hsieh RH，Lee YH，et al.The activated notch 1 receptor cooperates with alpha－enolase and mbp－1 in modulating c－myc activity〔J〕.Mol Cell Biol，2008，28(15):4829－4842.