全自動圖像細胞法、熒光原位雜交法、流式細胞儀對膀胱腫瘤的診斷和意義

顧沈陽 俞俊杰 劉亞東 王業(yè)華 杜擁軍

膀胱惡性腫瘤是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，而膀胱尿路上皮癌占膀胱惡性腫瘤的90%以上，隨著對膀胱癌遺傳學改變的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)膀胱癌的發(fā)生與3、7、17號染色體非整倍體改變及9號染色體p16位點缺失密切相關［1］。目前膀胱鏡檢查和尿脫落細胞學檢查是診斷和監(jiān)測膀胱尿路上皮癌最重要的2種手段。本研究采用ICM、FISH法和尿細胞檢查同時檢測40例膀胱尿路上皮癌患者和正常對照組20例非尿路上皮癌的患者尿液，比較3種方法的敏感性和特異性，以及VEGF和VEGFR在膀胱腫瘤組織及正常膀胱粘膜的表達情況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

FISH、ICM、尿細胞學檢查實驗對象:2008年8月至2009年3月我院收治40例膀胱腫瘤初發(fā)患者，男性29例，女性11例，年齡45.0～81.0歲，平均年齡68.5歲。腫瘤病理情況按 UICC標準分期:Ta期 2例，T1期8例，T2期 14例，T3期 11例，T4期 5例;按WHO標準進行分級 G1級10例，G2級21例，G3級9例。此40例患者均有病理診斷為膀胱尿路上皮癌。對照組20例非膀胱腫瘤患者，男性10例，女性10例，年齡42.0 ～75.0 歲，平均62.4 歲。

組織VEGF及VEGFR研究對象:病例組:收集我院2004年7月至2006年1月手術切除膀胱癌組織標本45例。標本均經(jīng)病理檢查證實為移行細胞癌。男性28例，女性17例，年齡31～82歲。WHO腫瘤病理分級標準:G1級17例，G2級14例，G3級14例;UICCWHO標準:Tis～T121例，T2～T424例。對照組:10例因良性前列腺增生而行開放手術所獲非腫瘤膀胱黏膜。

1.2 實驗方法

1.2.1 常規(guī)尿細胞學檢查 取晨尿200～400 ml，2 000 r/min離心5 min，棄上清?；靹蚝笥眉毎x心涂片機制片2張，干燥后加90%酒精固定10 min。顯微鏡鏡檢。

1.2.2 FISH法 收集樣本(晨尿)約300 ml，分裝于50 ml離心管中;2 000 r/min離心10 min，加入5 ml膠原酶B，用力吹打懸浮細胞;預固定;1 000 r/min離心10 min，去上清，室溫下緩慢加入5 ml固定液，固定10 min，，重復3次。56℃烤片機上烘烤30 min老化備用。40 μl 20 g/L胃蛋白酶工作液消化玻片10 min，將玻片依次置于4℃預冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中脫水，各3 min。取出玻片，自然晾干。滴加10 μl探針混合物滴加于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋玻片，用橡皮膠封蓋玻片邊緣。78℃ 5 min共變性，42℃ 過夜雜交。66℃洗滌1 min，0.1%NP-40/2×SSC，室溫洗滌1 min，70%乙醇室溫3 min。暗處自然干燥玻片，將10～12 μl DAPI復染劑滴加于玻片雜交區(qū)域，立即蓋上蓋玻片。暗處放置10～20 min，在熒光顯微鏡下選用無細胞疊加的濾片組觀察玻片。

1.2.3 ICM方法 用常規(guī)尿細胞學檢查方法制作2張細胞涂片，經(jīng)Thionin-Feulgen染色后，將涂片固定在Olympus BH-2顯微鏡上，同時用一個高分辨率的數(shù)碼相機進行掃描。濾色鏡波長(600±10)nm，系統(tǒng)分辨率為0.34 μm，單個細胞核的搜索可由一個獨特的片段聚焦系統(tǒng)自動完成，對可疑細胞圖像進行觀察、校對，該系統(tǒng)可搜集近5 000～10 000個細胞和非典型細胞核，獲取的細胞圖像中包括123種細胞特征參數(shù)，如形態(tài)特征、染色體分布、行程結構及局部特定特征等參數(shù)。搜集細胞核的圖像儲存在電腦中，根據(jù)每個細胞核的123個參數(shù)再用分類軟件自動進行受檢細胞的分類和計數(shù)，自動打印DNA倍體分析直方圖和細胞點陣分布圖。報告分為三部分，第一部分為DNA指數(shù)直方圖，第二部分為DI指數(shù)與細胞核面積坐標圖，第三部分為單個細胞核的DI值及其圖像。

1.2.4 FCM檢測VEGF和VEGFR表達 取手術切除的新鮮膀胱癌組織或非腫瘤膀胱黏膜組織約100 mg。所取標本一部分送病理檢查，另一部分制成單細胞懸液，之后進行抗原熒光染色。FCM分析:采用FACSCalibur型流式細胞儀，波長488 nm、功率15 mW氬離子激光器為光源進行單參數(shù)分析。檢測時每管收集10 000個細胞，CellQuest軟件系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)，以FSC和SSC為坐標軸作圖，以選定的目標細胞群設門，排除細胞碎片及其他細胞的影響。以PE-IgG1為陰性對照排除背景熒光的干擾，即可得出表達VEGF和VEGFR的陽性細胞數(shù)。

1.3 結果判定

1.3.1 常規(guī)尿脫落細胞學的結果判定 異常尿脫落細胞鏡下示細胞邊界清楚，圓形，大小不等。核大，大小不一。偏位，顯著異型。胞質較少，嗜堿性，胞核顯著異型的小細胞單個散在或聚結。每例患者每天檢查1次，連續(xù)3天，找到惡性細胞為陽性，3次均未找到病理細胞為陰性。

1.3.2 FISH法的結果判定 正常細胞呈3、7、17號著絲粒及p16位點二倍體，即正常細胞核可見2個紅色(p16基因或3號染色體)和2個綠色信號(17或7號染色體)。異常判斷標準:每個樣本人工在熒光顯微鏡下觀察200個不重疊的細胞核，人工統(tǒng)計信號數(shù)目，大于或等于閾值(3.9%)即可判斷為該指標異常，如果兩個或兩個以上指標異常則可以診斷為陽性。

1.3.3 ICM的結果判定 采用DI值即DNA指數(shù)判定，在直方圖中，DI值有3個或更多的異倍體細胞(DI值＞2.5或5 C，正常人染色體數(shù)目定義為二倍體，DNA定量細胞學常用C(content)作為單位來衡量DNA含量。1個C為正常細胞DNA含量的一半)出現(xiàn)即為陽性;如有1個或2個異倍體細胞(DI值＞2.5或5 C)即為懷疑，無DI值＞2.5或5 C的異倍體細胞出現(xiàn)，即為陰性。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，兩樣本率的比較采用四格表資料的χ2檢驗，等級變量間的相關關系用Spearman等級相關。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FISH、全自動圖像細胞法、尿細胞學檢查結果

對40例膀胱尿路上皮癌的檢測中，全自動圖像細胞法分析出25例陽性，總敏感性為62.5%，F(xiàn)ISH技術檢測出33例陽性，總敏感性為82.5%，常規(guī)尿脫落細胞學檢測出10例陽性，總敏感性25.0%。FISH技術的敏感性顯著高于全自動圖像細胞法(ICM)和常規(guī)尿細胞學的敏感性(P均＜0.05);全自動圖像細胞法敏感性顯著高于常規(guī)尿細胞學(P＜0.05)。在對20例非尿路上皮癌的3種檢測中未發(fā)現(xiàn)任何1例陽性。全自動圖像細胞法、FISH法和常規(guī)尿細胞學檢查的特異性都為100%，三者在特異性方面差異無統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。全自動圖像細胞法、FISH法和常規(guī)尿脫落細胞學檢測的敏感性與腫瘤病理分期無相關性(P＞0.05)(表1)，但與WHO分級有顯著相關(P＜0.05)(表2);即DNA全自動圖像細胞法、FISH法和常規(guī)尿脫落細胞學的陽性率隨著膀胱尿路上皮腫瘤級別的增高而增高，而與膀胱尿路上皮腫瘤的病理分期無關。

表1 膀胱尿路上皮癌UICC分期與ICM、FISH法和尿細胞學檢測結果的關系(例，%)

表2 40例膀胱尿路上皮癌患者WHO分級與ICM、FISH和尿細胞學檢測結果的關系(例，%)

2.2 VEGF、VEGFR在膀胱腫瘤組織及正常黏膜組織中的表達

FCM法檢測了45例新鮮膀胱癌組織中VEGF、VEGFR的表達水平(表 3)。45例膀胱癌組織中VEGF陽性表達率為(65.19±21.67)%，VEGFR 的陽性表達率為(42.29±16.68)%;非膀胱腫瘤組中VEGF、VEGFR的表達率均較低，兩者存在統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。在不同病理分期、病理分級中 VEGF、VEGFR表達也不同。VEGF、VEGFR在膀胱癌Ⅲ級中表達率最高，隨著腫瘤浸潤深度加深，VEGF、VEGFR的表達也隨之增強。

表3 FCM法檢測VEGF、VEGFR的表達情況(s，%)

表3 FCM法檢測VEGF、VEGFR的表達情況(s，%)

注:*為與對照組相比P＜0.01;△為與Ⅰ級、Ⅱ級相比P＜0.01;▲為與Tis～T1相比 P ＜0.01。

陽性率非腫瘤組項目 例數(shù) VEGF陽性率 VEGFR 10 8.32 ±2.86 0.99 ±0.24 BTCC 組 40 65.19 ±21.67* 42.29 ±16.68*病理分級Ⅰ級 15 38.56 ±6.30 25.83 ±2.65Ⅱ級 13 64.76 ±8.66 40.17 ±4.30Ⅲ級 12 87.48±7.05△ 64.39±5.42△浸潤深度Tis～ T1 16 45.43 ±11.60 28.07 ±5.37 T2～ T4 24 82.48 ±10.62▲ 54.73 ±12.68▲

3 討論

膀胱癌有多條染色體的變異，每條染色體異常與腫瘤分期、分級及預后相關性各不相同。近年來，細胞DNA含量定量分析方法廣泛應用于腫瘤研究領域，據(jù)文獻報道結果認為，DNA含量測定可以作為鑒別良惡性腫瘤及判定腫瘤分化程度的一項輔助指標［2-4］。用ICM檢測患者尿液中DNA倍體不僅能診斷出病變，而且可以通過分析DNA倍體細胞分布圖對腫瘤的惡性程度及預后做出判斷，所以在細胞學應用中有一定的優(yōu)勢。本實驗結果ICM法的敏感性為62.5%，顯著高于常規(guī)尿細胞學檢查，健康人對照組無1例陽性。ICM法標本制備簡單，對標本細胞要求數(shù)量不高，并能與細胞形態(tài)變化(面積、形態(tài)因子、紋理特征等)相結合，在膀胱尿路上皮癌的診斷中有常規(guī)尿細胞檢查不具備的優(yōu)越性，但其敏感性不如FISH法高。

從文獻報道來看，與膀胱癌發(fā)生相關的染色體位點有30多種，其中以p16基因缺失，3、7、17號染色體非整倍性發(fā)生概率最高，四者聯(lián)合的檢測率和敏感性最高。其中9號染色體單體性或雜合性缺失在淺表性膀胱腫瘤中最常見，這一異常與膀胱癌的早期發(fā)生密切相關，Vysis公司利用FISH法檢測出p16基因(定位于9p21);與9號染色體不同17號染色體的雜合性缺失被認為是膀胱癌發(fā)生過程中較晚的事件，但與腫瘤的分級和分期有關;7號染色體畸形也常見于膀胱癌，以三倍體多見，多伴有其他染色體改變，有研究表明它的倍數(shù)與腫瘤的分期和分級相關;3號染色體異常在膀胱尿路上皮癌約占30%，常與其他染色體異常并存。FISH檢測的是染色體的改變，所以可以在臨床病理發(fā)現(xiàn)前檢查到癌變傾向。國內陳順平等利用FISH對33例浸潤性尿路上皮癌患者進行檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ISH診斷敏感性為81.82%、特異性為91.67%。與我們的結果相似［5］。Luo等［6］取 21 例上尿路細胞癌連續(xù)病例和10例正常的尿液樣本，進行尿細胞學和FISH法檢測，F(xiàn)ISH法的總體敏感性為85.7%，顯著高于尿細胞學檢查的23.8%(P=0.0009);FISH法和尿細胞學檢查特異性均達到100%。Marin等［7］對74例已經(jīng)診斷為淺表性膀胱癌的患者分別用FISH法和尿細胞學方法檢測尿液樣本，通過用FISH法檢測染色體3、7、9和17。他們發(fā)現(xiàn)兩者在對淺表性膀胱癌診斷的敏感性上有著顯著性差異(分別是70.3%和35.1%;P＜0.0001)，這種差異同時存在于高分化(分別是52.8%和13.9%;P ＜0.0005)和低分化(分別是 86.8% 和55.3%;P ＜0.0015)腫瘤中;在特異性方面尿細胞學是100%，F(xiàn)ISH法是94.7%，尿細胞學懷疑是膀胱癌的FISH法有69%為陽性。

總之，雖然每個實驗室的探針的敏感性和特異性各不相同，但是FISH法總體的敏感性顯著高于常規(guī)尿細胞學和ICM法檢查，F(xiàn)ISH法的特異性和他們無明顯差異。FISH法作為一種新興技術在膀胱癌早期診斷和預后判斷中越來越顯示其優(yōu)越性，具有敏感度高、特異性強和無創(chuàng)性等優(yōu)點，但是其熒光容易減弱，試劑費用比較高，實驗操作流程比較復雜。

［1］Cianciulli AM，Leonardo C，Guadagni F，et al.Genetic instability in superficial bladder cancer and adjacent mucosa:an interphase cytogenetic study〔J〕.Hum Pathol，2003，34(3):214-221.

［2］Bocsi J，Perner F，Szücs J，et al.DNA content of parathyroid tumors〔J〕.Anticancer Res，1998，18(4B):2901-2904.

［3］Matturri L，Biondo B，Cazzullo A，et al.Prognostic significance of different biological markers(DNA index，PCNA index，apoptosis，p53，karyotype)in126 adenocarcinoma gastric biopsies〔J〕.Anticancer Res，1998，18(4B):2819-2825.

［4］Faranda A，Costa A，Canova S，et al.Image and flow cytometric analyses of DNA content in human solid tumors.A comparative study〔J〕.Anal Quant Cytol Histol，1997，19(4):338-344.

［5］陳順平，劉 偉，余英豪，等.熒光原位雜交技術在膀胱尿路上皮腫瘤病理學診斷中的初步應用〔J〕.實用癌癥雜志，2011，26(5):441-443，447.

［6］Luo B，Li W，Deng CH，et al.Utility of fluorescence in situ hybridization in the diagnosis of upper urinary tract urothelial carcinoma〔J〕.Cancer Genet Cytogenet，2009，189(2):93-97.

［7］Marín-Aguilera M，Mengual L，Ribal MJ，et al.Utility of a multiprobe fluorescence in situ hybridization assay in the detection of superficial urothelial bladder cancer〔J〕.Cancer Genet Cytogenet，2007，173(2):131-135.