干旱脅迫對鴨茅根、葉保護酶活性、滲透物質(zhì)含量及膜質(zhì)過氧化作用的影響

季楊，張新全，彭燕，梁小玉，黃琳凱，馬嘯，馬迎梅

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院草業(yè)科學系，四川 雅安625014；2.四川省畜牧科學研究院，四川 成都610066）

鴨茅（Dactylis glomerata）是世界著名優(yōu)良的多年生冷季型禾本科牧草，具有產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)良、適應性強、再生速度快、耐陰性好、須根發(fā)達等習性被大量應用于草山草坡改良及喀斯特地區(qū)石漠化治理等，是一種優(yōu)良的多用途草類資源，具有較高的應用價值和開發(fā)前景。然而，干旱作為一個世界性問題，是影響植物在形態(tài)、生理及基因表達水平上發(fā)生變化，限制植物生長發(fā)育和產(chǎn)量提高的主要逆境因子之一［1-2］。因此，在淡水資源嚴重匱乏的環(huán)境壓力下，開展鴨茅抗旱性研究具有重要的應用價值。

植物的抗旱性主要表現(xiàn)在滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累、膜脂成分的變化、自由基的清除作用以及蛋白的誘導形成激素調(diào)節(jié)等綜合因素作用的結(jié)果［3］。干旱脅迫引起植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除系統(tǒng)之間失衡，生物自由基的累積引起膜傷害和膜脂過氧化等，而植物體內(nèi)一系列的抗氧化酶類和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（包括可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸等）組成的抗氧化防御系統(tǒng)以清除這些活性氧自由基［4-5］，同時起到保護細胞內(nèi)生物大分子結(jié)構(gòu)的作用［6］。目前，關(guān)于研究干旱脅迫對鴨茅生理特性影響的研究較少，且主要集中在鴨茅葉片中滲透調(diào)節(jié)和抗氧化酶活性變化對水分脅迫的響應［7-9］。干旱脅迫同時對鴨茅根系、葉片的滲透調(diào)節(jié)作用和抗氧化系統(tǒng)的保護作用進行的研究尚未見報道。本研究以2種不同鴨茅基因型為試驗材料，即耐旱型鴨茅材料“寶興”和敏感型鴨茅材料“01998”［8］，比較鴨茅根、葉抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對干旱脅迫的響應，進一步完善鴨茅的抗旱機理，為鴨茅的抗旱品種選育和節(jié)水高產(chǎn)栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試鴨茅材料為2個不同抗旱性的基因型材料（耐旱型 “寶興”和敏感型“01998”）。從四川農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科學系農(nóng)場的資源圃采集已種植2年的供試材料，將采集的2個單株群體再各分成36株植株，為促使其再次分蘗和長出新根，保留約4 cm株高和2 cm的根系，培育3個月后再次分株定植于花盆，每盆定植3株（口徑16 cm，地徑12 cm，高13 cm）。土壤的沙和粘土為1∶1（v／v），裝土量為4 kg，土壤持水量為31%，土壤類型為沙壤土，其基本理化性質(zhì)為：土壤田間持水量31%，有機質(zhì)11.4 g／kg，速效氮70.21 mg／kg，速效磷21.68 mg／kg，速效鉀61.58 mg／kg。移栽后5 d澆灌5.0 mmol／L Hoagland營養(yǎng)液，室外培養(yǎng)2個月。待根系建成后移入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度設(shè)置為22℃／15℃（晝／夜），相對含水量70%，光照300μmol／（m2·s），光周期14 h／10 h（晝／夜）。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2011年3－10月在四川農(nóng)業(yè)大學溫江校區(qū)草學系溫棚實施。共設(shè)2個處理，分別是干旱處理和澆水對照處理，每個處理設(shè)3個重復，其中根系的干旱處理和澆水對照在每個時間點上均有3個重復。實驗處理前保持7 cm冠層高度，保持土壤相對含水量在50%左右，開始干旱處理后停止?jié)菜?。對供試材料進行干旱處理24 d，分別于干旱處理的第0，9，18，21，24天上午10：00時采集根系及葉片樣品并測定各項生理指標。

1.3 測定指標與方法

在干旱處理的第0，9，18，21，24天分別取頂部第1片展開葉，并用紗布擦干。根部利用水沖法洗凈，取用根尖部位樣品分別測定各項生理指標。

根系活力（root vitality）采用四氮唑法（TTC還原法）測定［10］。相對含水量（relative water content）采用烘干法測定［11］，相對含水量（RWC）（%）＝［（鮮重－干重）／（飽和鮮重－干重）］×100%。丙二醛（malondialdehyde，MDA）采用硫代巴比妥酸法測定［12］。電導率（electrolyte leakage，EL）采用電導儀測定［13］。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性采用核黃素-NBT法測定［14］。過氧化氫酶（catalase，CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性采用紫外吸收法測定［15］。過氧化物酶（guaiacol peroxidase，POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法［16］測定。游離脯氨酸（free proline）含量采用茚三酮比色法測定［17］?？扇苄蕴牵╯oluble sugar）含量采用蒽酮乙酸乙酯比色法測定［17］?？扇苄缘鞍祝╯oluble protein）含量采用考馬斯亮藍G-250法測定［18］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及繪圖；SAS 8.1軟件進行數(shù)據(jù)分析，用最小差異檢驗方法進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脅迫時間下土壤含水量（SWC）的變化

干旱脅迫過程中土壤含水量的變化如圖1，在試驗過程中，隨著干旱脅迫時間的延長，土壤含水量持續(xù)下降。在干旱處理9 d后，“寶興”比“01998”表現(xiàn)出更高的土壤含水量優(yōu)勢（圖1），從圖中的LSD值可以看出，在整個脅迫處理期間，種植不同基因型鴨茅土壤含水量在P＜0.05水平下差異不顯著。

2.2 干旱脅迫對鴨茅葉片含水量及根系活力的影響

植物葉片相對含水量（RWC）是反映植物在逆境脅迫下的整體水分虧缺狀況。由圖2A可以看出，隨著干旱時間的延長，2種基因型的鴨茅相對含水量都呈逐步遞減的趨勢。其中，耐旱型品種“寶興”的相對含水量在整個試驗期間均高于敏感型材料“01998”，并且在干旱第21天時顯著高于“01998”。

圖1 土壤質(zhì)量含水量（SWC）在干旱脅迫處理下的變化Fig.1 Changes of soil water content under drought stress圖中豎條表示最小顯著差異，不同基因型間不同字母者表示差異顯著（P＜0.05）。下同。Vertical bars represent least significant difference，different genotypes of orchardgrass from leaf sizes followed by different small letters are significantly different at P＜0.05.The same below.

圖2 干旱脅迫下鴨茅葉片相對含水量和根系活力的變化Fig.2 Changes of leaf relative water content and root vitality of orchardgrass under drought stress

由圖2B可知，不同耐旱型鴨茅根系活力均呈先增強后下降的趨勢。干旱脅迫初期明顯提高了2種不同耐旱型鴨茅的根系活力，但隨著干旱時間的延長，干旱18 d后，2個基因型材料均出現(xiàn)明顯下降趨勢，其中 “寶興”鴨茅的根系活力在整個試驗期間均高于“01998”，但差異不顯著。

2.3 干旱脅迫對根系及葉片細胞膜穩(wěn)定性的影響

丙二醛（MDA）是植物細胞膜脂過氧化傷害的主要產(chǎn)物之一，MDA含量通常用于評價膜脂過氧化的程度。從圖3A可以看出，隨著干旱脅迫時間的延長，根系和葉片MDA含量均呈逐漸增加的趨勢，其中根系MDA含量相對增加量小于葉片。在整個試驗期間，耐旱型“寶興”根系維持較低的MDA含量增加量，同時“寶興”和“01998”的根系在不同脅迫時間處理下差異均不顯著；而“寶興”葉片MDA含量在干旱脅迫處理第18天開始就一直顯著低于“01998”。

電導率是評價植物細胞膜穩(wěn)定性的一個重要指標。由圖3B可知，干旱處理條件下，不同基因型鴨茅電導率與丙二醛變化趨勢類似，但根系電導率值在干旱初期明顯高于葉片。在整個試驗期間，“寶興”的根系和葉片的電導率均低于“01998”，其中在干旱第18～21天期間，根系中“寶興”電導率顯著低于“01998”。

圖3 干旱脅迫下根系及葉片對細胞膜穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of cell membrane stability in roots and leaves of orchardgrass under drought stress

2.4 干旱脅迫對根系及葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

游離脯氨酸和可溶性糖是植物體內(nèi)較為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。干旱脅迫初期，2個品種的根系和葉片中脯氨酸含量基本相同，都保持在相對較低的水平，而葉片中可溶性糖含量在脅迫初期顯著高于根系（圖4A，4B）。隨著干旱脅迫時間的延長，根系及葉片中游離脯氨酸和可溶性糖含量均呈逐漸增加的趨勢。在整個干旱處理期間，耐旱型品種“寶興”的根系和葉片中游離脯氨酸和可溶性糖含量均高于“01998”，其中葉片脯氨酸含量在干旱18 d后顯著高于敏感型材料“01998”。

可溶性蛋白作為另一種重要的有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在缺水情況下起保水作用。隨著干旱脅迫進程的推進，根系及葉片可溶性蛋白含量逐漸升高，葉片可溶性蛋白含量在脅迫后第9天達最大值，而根系則在第18天達最大值，之后皆開始降低，呈單峰曲線變化（圖4C）。葉片與根系比較，根系可溶性蛋白含量相對變化量小于葉片。

圖4 不同干旱脅迫對鴨茅根系和葉片脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量變化的影響Fig.4 Effect of free proline content，total soluble sugar content and soluble protein content in roots and leaves of orchardgrass under drought stress

2.5 干旱脅迫對根系及葉片保護酶活性變化的影響

2個鴨茅材料的根系及葉片SOD活性隨著干旱時間的延長逐漸升高，并在干旱第18天達到最大值，干旱18 d后急劇下降。與“寶興”SOD活性不同的是，干旱第24天的“01998”SOD活性低于0 d時的SOD活性（圖5A）。與“01998”比較，“寶興”的根系和葉片在整個干旱處理階段均維持著較高的SOD活性水平。其中，根系SOD活性在干旱第9和18天顯著高于“01998”，而葉片SOD活性在干旱第18和21天顯著高于“01998”。

2種鴨茅根系和葉片CAT活性在干旱脅迫條件下變化趨勢一致，即隨著干旱脅迫時間的延長，CAT活性先上升后下降，只是根系CAT活性保持著較低的增長趨勢，而葉片中CAT活性保持較高的增長趨勢。2種鴨茅的根系及葉片CAT活性均在干旱第18天達到最大值，并在之后呈緩慢下降趨勢（圖5B）。“寶興”根系和葉片的CAT活性在整個干旱處理期間均高于“01998”。其中，“寶興”根系中CAT活性在干旱第9天到第18天期間顯著高于“01998”；而葉片中CAT活性在干旱第9天到第21天期間顯著高于“01998”。

2種鴨茅在干旱0天時，與葉片中POD活性比較，根系中POD活性維持著較高的水平。在干旱脅迫初期，2種鴨茅的根系及葉片POD活性保持較低的增長趨勢，隨著干旱時間的延長和程度的加重，二者的根系和葉片POD活性急劇上升，在干旱處理第18天時分別達到最大值；干旱處理18 d后，2種耐旱型鴨茅根系和葉片POD活性均急劇下降，但“寶興”根系和葉片POD活性在干旱第18，21，24天均顯著高于“01998”（圖5C）。

2種鴨茅根系和葉片APX活性在干旱脅迫條件下變化趨勢一致，即隨著干旱脅迫時間的延長，APX活性先上升后下降，2種鴨茅的根系及葉片均在干旱第18天達到最大值，并在之后呈緩慢下降趨勢（圖5D）。“寶興”根系和葉片的APX活性在整個干旱處理期間均高于“01998”，其中，在干旱第21天“寶興”根系中APX活性顯著高于“01998”。

圖5 不同干旱處理對鴨茅保護酶系SOD、CAT、POD、APX活性變化的影響Fig.5 Dynamics of variation of SOD，CAT，POD and APX activity of orcardgrass under different drought treatments

3 討論

干旱是限制植物生長和發(fā)育最主要的逆境因子之一，干旱脅迫往往會造成植物體內(nèi)大量活性氧的積累，這些活性氧導致膜脂過氧化水平增高，生成具有強氧化性的脂質(zhì)過氧化物，其中丙二醛（MDA）是膜質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物之一，具有很強的細胞毒性，被廣泛地用作氧化損傷的分析［19］，許多研究都將MDA含量作為衡量植物耐旱性強弱的一個重要指標［20-22］。MDA含量高低和細胞質(zhì)膜透性變化是反映細胞膜脂過氧化作用強弱和質(zhì)膜破壞程度的重要指標［19］。本試驗結(jié)果表明，干旱脅迫下2個基因型的根系和葉片MDA含量呈不斷增加趨勢，表明膜系統(tǒng)均受到一定損傷，隨著干旱脅迫時間的延長而加??；其中2個基因型的根系MDA含量在整個試驗期間差異不顯著，而2個基因型的葉片中MDA含量增幅較為明顯，其中“寶興”葉片MDA含量增幅較小，脂質(zhì)過氧化程度相對較低，膜透性隨干旱程度的增幅也較小，表現(xiàn)出較強的耐旱性。Sharma和Dubey［23］及Li等［24］在小麥（Triticum aestivum）和白三葉（Trifolium repens）的研究中得出同樣結(jié)果，即干旱脅迫下根系中MDA含量增長幅度較小，膜質(zhì)過氧化程度低于葉片。表明葉片脂膜過氧化產(chǎn)物MDA累積幅度大，在干旱過程中葉片所受傷害重于根系。

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等）的積累是植物適應干旱脅迫的基本特征之一。這些物質(zhì)的積累可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的滲透勢，維持水分平衡，保護細胞內(nèi)重要代謝活動所需的酶類活性，且一般認為抗旱性強的品種滲透調(diào)節(jié)能力較強［8-9，25］。本研究結(jié)果表明，隨著干旱脅迫時間的延長，2種不同基因型鴨茅根系及葉片的脯氨酸含量和可溶性糖含量逐漸增加。相較于敏感型材料“01998”，耐旱型品種“寶興”根系及葉片的脯氨酸含量和可溶性糖含量在整個干旱期間增幅更明顯。表明“寶興”根系及葉片內(nèi)脯氨酸和可溶性糖響應干旱代謝系統(tǒng)更為敏感和快速，抗旱性更強?？扇苄缘鞍缀渴侵参矬w代謝過程中蛋白質(zhì)損傷的重要指標，其變化可以反映細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、變性及降解等多方面的信息［26］?？悼∶返龋?7］對苜蓿（Medicago sativa）葉片的研究表明，干旱強度直接影響可溶性蛋白含量變化，即隨著脅迫強度的增加可溶性蛋白呈先增強后減弱的趨勢。陳明濤等［28］對刺槐（Robinia pseudoacacia）、側(cè)柏（Platycladus orientalis）根尖可溶性蛋白含量變化規(guī)律研究表明，輕度干旱脅迫導致可溶性蛋白含量上升，而中度或重度干旱脅迫導致可溶性蛋白含量下降，且脅迫程度越強，下降幅度越大。本試驗中鴨茅根系及葉片的可溶性蛋白變化規(guī)律與上述研究一致。韓蕊蓮等［29］研究結(jié)果指出，隨著干旱時間的延長，脅迫程度的加重，植物體內(nèi)的分解代謝大于合成代謝，導致可溶性蛋白大量降解。這可能就是解釋中度和重度脅迫條件下可溶性蛋白含量減少現(xiàn)象。鴨茅根系滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與葉片相比，葉片中可溶性糖和可溶性蛋白的含量高于根系，而根系中的游離氨基酸的相對增加量則大于葉片，這可能由于葉片是糖的主要產(chǎn)生部位，而根系則可以合成氨基酸有關(guān)。

干旱脅迫是影響植物生長和代謝的主要逆境因子之一，干旱誘導植物細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，與生物大分子發(fā)生氧化反應，生成具有強氧化性的膜質(zhì)過氧化物和各種小分子的降解物，導致膜質(zhì)過氧化、破壞膜的完整性、降低保護酶的活性［30］。為了防御、減少氧化損害，植物需要合理調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化清除系統(tǒng)，SOD、CAT、POD、APX就屬于這一系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶［31］。SOD作為重要的自由基清除酶，能催化·O2發(fā)生歧化作用而轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，從而減輕超氧陰離子對植物體的毒害作用［32］。而產(chǎn)物H2O2可轉(zhuǎn)化導致膜質(zhì)過氧化的活性氧O2－。CAT、POD、APX主要清除不同細胞定位的H2O2，也就是SOD催化·O2的產(chǎn)物［33］。因此需要SOD、CAT、POD、APX的協(xié)同作用，共同防御活性氧大量積累造成的氧脅迫毒害。本研究結(jié)果表明，隨著干旱脅迫時間的延長，2種鴨茅根系和葉片中SOD、CAT、POD、APX活性呈現(xiàn)出一致的反應，即先增強后下降的趨勢。在干旱脅迫第0，9，18天，2種鴨茅的根系及葉片通過升高SOD、CAT、POD、APX活性來防止活性氧大量積累造成的氧脅迫毒害，其中“寶興”的SOD、CAT、POD、APX活性明顯高于“01998”，表現(xiàn)出較強的抗旱能力。干旱18 d后，2種鴨茅根系及葉片中4種酶活性都急劇下降，表明此時鴨茅體內(nèi)活性氧的形成和清除系統(tǒng)之間的平衡被打破。但是，在干旱脅迫第24天，“寶興”鴨茅根系及葉片的POD活性顯著高于“01998”，表明重度干旱脅迫并沒有減弱POD清除H2O2和單態(tài)氧的能力。說明“寶興”鴨茅在干旱條件下抗氧化清除系統(tǒng)響應更積極、更持久，具有比“01998”更高的清除活性氧的能力。