嘧菌酯在牧草和土壤中的殘留規(guī)律研究

張志勇，簡(jiǎn)秋，宋穩(wěn)成，孫星，楊邦保

（1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（南京），江蘇 南京210014；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，北京100125）

嘧菌酯（azoxytrobin）是一種仿生合成的具有內(nèi)吸性β-甲氧基丙烯酸酯類廣譜殺菌劑［1-2］，其主要作用機(jī)理是線粒體呼吸抑制劑［3］。該藥于1992年發(fā)現(xiàn)后，于1996年以Amistar（阿米西達(dá)）為商品名在歐洲首先開發(fā)，隨后在1999年獲得中國(guó)行政保護(hù)［4］。由于嘧菌酯具有殺菌廣譜、持效期長(zhǎng)、活性高、毒性低、對(duì)非靶標(biāo)生物安全的特點(diǎn)，使其在新品種殺菌劑農(nóng)藥中擁有廣闊的應(yīng)用前景［5］。目前，嘧菌酯主要應(yīng)用于果蔬、水稻（Oryza sativa）、人參（Panax ginseng）等作物，并對(duì)這些作物有很高的安全性［6-10］。國(guó)內(nèi)外已有許多有關(guān)該藥在農(nóng)產(chǎn)品如芒果（Mangifera indica）［11］、葡萄（Vitis vinifera）［12］、西蘭花（Brassica oleracea var.italica）和荷蘭豆（Pisum sativum var.saccharatum）［5］、水［13］等的殘留檢測(cè)方法和在大豆（Glycine max）中的殘留規(guī)律［14］以及其在人參和西洋參中的殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估［15］等報(bào)道。我國(guó)許多地區(qū)牧草資源豐富、牧業(yè)發(fā)展前景好［16-17］，但牧草上容易出現(xiàn)枯萎病、黑粉病、炭疽病等病害，使用的殺菌劑也較多［18］，目前尚未見殺菌劑在牧草上的殘留規(guī)律研究報(bào)道，因此，其在牧草上應(yīng)用后對(duì)環(huán)境、人類的健康風(fēng)險(xiǎn)也未知。為保證該藥在牧草上的合理使用和對(duì)環(huán)境、人類健康的保護(hù)，有必要開展其在牧草系統(tǒng)中的殘留規(guī)律研究。本研究采用液質(zhì)聯(lián)用儀分析嘧菌酯在北京、江蘇南京和河南鄭州一年三地牧草和土壤中的殘留動(dòng)態(tài)和最終殘留規(guī)律，以探明該藥在牧草系統(tǒng)中的殘留風(fēng)險(xiǎn)，為指導(dǎo)該藥在牧草種植和管理中的合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 主要儀器 Agilent 1200SL-6410A液質(zhì)聯(lián)用儀，色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18 2.1 mm×150 mm（3.5μm）及ZORBAX SB-Aq Narrow-Bore Guard Column 2.1 mm×12.5 mm （5μm）（預(yù)柱）。

1.1.2 試劑 乙腈（分析純用于樣品提??；色譜純用于流動(dòng)相）；甲醇（分析純用于樣品提?。簧V純用于流動(dòng)相）；乙酸乙酯、丙酮和正己烷均為分析純；Agilent氨基小柱（5 m L，1 g）；超純水；嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度98.0%（Sigma公司）；20%嘧菌酯水分散粒劑（市售）。

1.1.3 標(biāo)樣的配制 精確稱取嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)品 （精確至0.1 mg），甲醇定容至50.0 m L，配成標(biāo)準(zhǔn)母液。再用空白牧草和土壤的提取液配制成0.01，0.05，0.10，0.25，0.50，1.00 mg／L系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。配制好的標(biāo)準(zhǔn)工作液置于4℃冰箱中備用。

1.2 田間試驗(yàn)

參照《農(nóng)藥登記殘留田間試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》［19］，于2012年分別在北京市、江蘇省南京市、河南省鄭州市3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行殘留試驗(yàn)。各試驗(yàn)點(diǎn)分別設(shè)牧草低劑量（400 g a.i.／hm2，gram active ingredients）施藥3和4次（間隔7 d施藥1次），牧草高劑量（600 g a.i.／hm2）施藥3和4次（間隔7 d施藥1次）4個(gè)最終殘留試驗(yàn)處理，同時(shí)設(shè)牧草殘留消解動(dòng)態(tài)和土壤消解動(dòng)態(tài)（均為600 g a.i.／hm2）各施藥1次2個(gè)消解動(dòng)態(tài)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，每小區(qū)面積20 m2（4 m×5 m），同時(shí)設(shè)不施藥對(duì)照小區(qū)。

最終殘留試驗(yàn)處理牧草和土壤樣品的采收：在最后1次施藥后7，14和21 d后，隨機(jī)在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)不同方向及上下不同部位采集不少于1 kg生長(zhǎng)正常、無病害、成熟的植株；同時(shí)用土壤采樣器在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選6～12個(gè)采樣點(diǎn)，采集地表以下0～15 cm土壤。

牧草殘留動(dòng)態(tài)試驗(yàn)處理牧草樣品的采收：于施藥后0 d（2 h），1，3，5，7，10，14和21 d采用隨機(jī)的方法在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)不同方向及上下不同部位采集不少于1 kg生長(zhǎng)正常、無病害、成熟的植株。

土壤殘留動(dòng)態(tài)試驗(yàn)處理土壤樣品的采收：于施藥后0 d（2 h），1，3，5，7，10，14和21 d隨機(jī)選取10個(gè)以上采樣點(diǎn)，用土壤取樣器隨機(jī)取0～10 cm深土樣1 kg左右。

1.3 樣品制備

將采集到的牧草樣本用搗碎機(jī)搗碎，裝入密封袋中，貯存于－20℃冰箱內(nèi)待分析。將采集到的土壤樣本混合均勻，貯存于－20℃冰箱內(nèi)待分析。

1.4 殘留分析方法

牧草和土壤中嘧菌酯殘留分析方法參考文獻(xiàn)［10-12］并加以改進(jìn)，具體提取凈化和檢測(cè)方法如下。

1.4.1 提取 稱20.0 g牧草植株或土壤樣品于125 m L試劑瓶中，加40 m L乙酸乙酯，勻漿2 min，振蕩2 h，過濾，待分層取有機(jī)相液10 m L，氮吹至干，1 m L丙酮＋正己烷（1∶9，V／V）定容。

1.4.2 凈化 氨基小柱用丙酮4 m L，正己烷2 m L預(yù)淋洗，加樣液，加3 m L丙酮＋正己烷（1∶9，V／V），棄去流出液，用10 m L甲醇＋丙酮（1∶1，V／V）洗脫，收集洗脫液，氮吹至干，1 m L甲醇定容。

1.4.3 儀器條件 采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。柱溫：30℃；流動(dòng)相為乙腈∶水（含0.1%甲酸）＝80∶20；流速：0.25 m L／min；進(jìn)樣量：5.0μL；離子源：ESI正模式；掃描方式：MRM；毛細(xì)管電壓：4.0 k V；干燥氣：10 L／min；溫度：350℃；霧化氣：30 psi。在上述條件下，嘧菌酯定量離子為295.3＞193.1（碰撞能量：25 e V），定性離子為295.3＞134.1（碰撞能量：55 eV），保留時(shí)間為2.9 min左右。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 回收率與最低檢出限

分別在空白牧草植株或土壤樣品中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的嘧菌酯標(biāo)樣（0.01，0.10，1.00 mg／kg），按上述提取、凈化和儀器分析步驟進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)添加水平重復(fù)5次。添加回收試驗(yàn)結(jié)果表明，嘧菌酯在牧草植株中平均回收率為86.5%～97.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.1%～10.3%；在土壤中平均回收率為82.4%～107.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～5.7%。該方法對(duì)牧草和土壤中嘧菌酯殘留的最低檢出限均為0.01 mg／kg。結(jié)果表明該方法符合 NY／T 788-2004《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》的要求［20］。

2.2 嘧菌酯在牧草植株和土壤中的殘留動(dòng)態(tài)

嘧菌酯在北京市、江蘇省南京市和河南省鄭州市3個(gè)不同試驗(yàn)點(diǎn)牧草植株和土壤中的殘留消解動(dòng)態(tài)見圖1和圖2，降解動(dòng)力學(xué)方程見表1。嘧菌酯在牧草和土壤樣品中的降解計(jì)算采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程式（Ct＝C0e－kt），式中，Ct為處理t天后嘧菌酯在不同樣品中的濃度，C0為起始濃度，k為一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程降解常數(shù)，半衰期（t0.5）＝ln 2／k［21-23］。試驗(yàn)結(jié)果表明，在施藥當(dāng)天，嘧菌酯在各試驗(yàn)點(diǎn)牧草中的殘留量為1.43～3.22 mg／kg，在土壤中的殘留量為1.55～4.21 mg／kg，隨著采樣時(shí)間的延長(zhǎng)，牧草植株中嘧菌酯的含量均降低。嘧菌酯在不同試驗(yàn)點(diǎn)牧草中的原始沉積量差異較大（北京：1.43 mg／kg；江蘇：3.22 mg／kg；河南：1.84 mg／kg），這可能由所種植牧草品種不同而引起的牧草植株表面積存在差異而導(dǎo)致農(nóng)藥在植株上的原始沉積量不同，也有可能是因?yàn)椴煌囼?yàn)點(diǎn)的種植密度不同而導(dǎo)致牧草著藥量不同。同時(shí)，施藥的天氣條件，如溫度、相對(duì)濕度、風(fēng)速等也有可能導(dǎo)致嘧菌酯在不同試驗(yàn)點(diǎn)牧草上原始沉積量存在差異。在施藥后5 d，嘧菌酯在3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)牧草中的降解率均達(dá)到50%以上。施藥后21 d，嘧菌酯在牧草中的降解率均達(dá)到了95%以上。在施藥后5 d，嘧菌酯在3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)種植牧草土壤中降解率也均超過了50%，施藥后21 d，嘧菌酯在3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)牧草植株中的降解率均為98%以上。嘧菌酯在牧草植株和土壤中的半衰期均較短，為2.9～3.7 d。在北京試驗(yàn)點(diǎn)牧草中的半衰期最長(zhǎng)（3.4 d），在江蘇省南京市的半衰期最短（2.9 d）。在河南省鄭州市試驗(yàn)點(diǎn)土壤中的半衰期最長(zhǎng)（3.7 d），在北京市試驗(yàn)點(diǎn)土壤中的半衰期最短（3.2 d）。

圖1 嘧菌酯在牧草植株中的殘留消解動(dòng)態(tài)Fig.1 Degradation dynamics of azoxystrobin in forages

圖2 嘧菌酯在土壤中的殘留消解動(dòng)態(tài)Fig.2 Degradation dynamics of azoxystrobin in soils

表1 嘧菌酯在牧草植株和土壤中的消解動(dòng)力學(xué)方程Table 1 Degradation equations of azoxystrobin in forages and soils

2.3 嘧菌酯在牧草植株和土壤中的最終殘留

按低劑量、高劑量分別施藥3和4次后，在距最后1次施藥7，14和21 d時(shí)牧草和土壤樣品中嘧菌酯殘留量見表2和3。嘧菌酯在牧草中的殘留量為0.04～3.72 mg／kg。低劑量和高劑量施藥3和4次處理，在最后1次施藥后21 d，牧草中嘧菌酯均＜1 mg／kg。種植牧草的土壤中嘧菌酯的含量為0.11～3.21 mg／kg。結(jié)果還表明，在相同施藥劑量和施藥次數(shù)條件下，隨著采樣間隔期的延長(zhǎng)，各試驗(yàn)點(diǎn)牧草植株和土壤中嘧菌酯的殘留量隨之下降；在相同采收間隔期和施藥次數(shù)條件下，各試驗(yàn)點(diǎn)高劑量處理牧草植株和土壤中嘧菌酯殘留量均高于低劑量處理；在相同采收間隔期和施藥劑量條件下，各試驗(yàn)點(diǎn)牧草中的嘧菌酯殘留量隨著用藥次數(shù)的增加而增加。

表2 嘧菌酯在牧草中的最終殘留量（平均±標(biāo)準(zhǔn)差）Table 2 Final residue levels of azoxystrobin in forage（Mean±SD） mg／kg

表3 嘧菌酯在土壤中的最終殘留量（平均±標(biāo)準(zhǔn)差）Table 3 Final residue levels of azoxystrobin in soil（Mean±SD） mg／kg

3 討論與結(jié)論

由于嘧菌酯為第一個(gè)商品化的甲氧基丙烯酸酯類廣譜殺菌劑，具有高效、廣譜、保護(hù)、治療、鏟除、滲透、內(nèi)吸活性等特點(diǎn)，幾乎可以防治所有真菌（卵菌綱、藻菌綱、子囊菌綱和半知菌綱）病害。因此在我國(guó)已有約100個(gè)產(chǎn)品取得了登記，登記作物包括蔬菜、水果、糧谷類和牧草等。農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留量受施藥量、施藥次數(shù)、采收安全間隔期、農(nóng)藥種類（化學(xué)結(jié)構(gòu)）、劑型、施藥時(shí)期及方式、農(nóng)作物的種類及光、熱、溫度、濕度、微生物等環(huán)境因子的影響。在本研究中，嘧菌酯在3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)最終殘留量和殘留動(dòng)態(tài)的原始沉積量均有較大差異，可能與施藥環(huán)境和作物種類有較大關(guān)系。嘧菌酯每日允許攝入量（ADI）為0.02 mg／kg體重。目前我國(guó)尚未制定牧草中嘧菌酯的最大殘留限量（MRL）。CAC殘留限量標(biāo)準(zhǔn)中嘧菌酯在谷物飼料和干秸稈中的MRL值為15 mg／kg。為了保障牧草的安全，有必要研究嘧菌酯在我國(guó)不同典型牧草種植區(qū)域的殘留規(guī)律和最終殘留量，從而為盡快制定其在相關(guān)作物上MRL和其殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

本研究所建立的牧草和土壤中嘧菌酯殘留分析方法檢出限低（0.01 mg／kg），前處理方法簡(jiǎn)便且效率高，完全能夠滿足市場(chǎng)監(jiān)測(cè)和農(nóng)藥登記殘留試驗(yàn)中嘧菌酯殘留的檢測(cè)。嘧菌酯按高低2個(gè)施藥劑量、分別施藥3和4次21 d后采樣，牧草中嘧菌酯殘留量均＜2 mg／kg，參照CAC制定的干秸稈和飲料中嘧菌酯的 MRL（15 mg／kg），按推薦的劑量施藥21 d后采收牧草是安全的。