內(nèi)生細(xì)菌YBS106菌株發(fā)酵條件優(yōu)化①

林天興++管芩瀾++龔明福

摘 要：對(duì)一把傘南星內(nèi)生細(xì)菌YBS106發(fā)酵條件進(jìn)行研究，確定其最佳發(fā)酵液培養(yǎng)基配方和最佳發(fā)酵條件。通過(guò)杯碟法測(cè)定YBS106發(fā)酵液對(duì)棉花枯萎病原菌的抑菌作用，研究了該菌株在不同培養(yǎng)基，不同生長(zhǎng)條件下的代謝產(chǎn)物活性。菌株YBS106的最佳生長(zhǎng)條件為：pH7.0，28℃，發(fā)酵72 h，接種量4%，揺床轉(zhuǎn)速為200 r/min。在最佳培養(yǎng)條件下，該菌株對(duì)棉花枯萎病菌的抑菌率可達(dá)56%。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生細(xì)菌 棉花枯萎病 發(fā)酵條件 抑菌

中圖分類(lèi)號(hào)：S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2014）02（c）-0140-02

Abstract：Study the fermentation conditions of a kind of endophytic bacteria YBS106 which was isolated from Arisaema erubescens in Emei Mount. to optimize the culture medium ingredients and the fermentation conditions. Use cylinder plate method to determine the antifungal activity of YBS106 fermenting solution against Fusarium oxysporum. It was shown that the optimal culture conditions were：medium initial pH 6.0， temperature 28℃， the inoculation 4%， cultivation time 72 h with 200 r/min rotating speed. Under the optimum fermenting solution and culture conditions， the inhibition ratio of YBS106 fermenting solution against F. oxysporum can reach to 56%.

KeyWords：Endophytic Bacteria；Fusarium Oxysporum；Fermentation Condition；Bacteriostasis

棉花枯萎?。‵usarium oxysporum）是一種由棉花尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporium f. sp. vasinfectum）引起的、具有毀滅性的土傳棉花病害，在外界環(huán)境條件有利于枯萎病發(fā)生的情況下可引起棉花大幅度減產(chǎn)[1]。通過(guò)生物防治方法減少或抑制土壤中病菌接種體數(shù)量或致病活性，在小麥全蝕病等土傳病害防治中已有成功報(bào)道[2]。利用生防措施來(lái)控制棉花枯萎病為廣大科研工作者所期望，但目前為止尚缺乏高效穩(wěn)定的生防菌株。內(nèi)生細(xì)菌是一類(lèi)生長(zhǎng)在植物組織細(xì)胞間隙的微生物，其中部分內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與宿主相關(guān)的活性成分，是生防微生物的重要來(lái)源。

本課題組從一把傘南星（Arisaema erubescens （Wall.） Schott）組織中分離到一株對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus， MRSA）和F. oxysporium具有高拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌YBS106，同時(shí)也能誘導(dǎo)棉花產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。

對(duì)微生物發(fā)酵工藝的優(yōu)化主要包括初始條件的選擇，培養(yǎng)基的組成配比及培養(yǎng)條件的優(yōu)化幾個(gè)方面[3]。本研究旨在對(duì)棉花枯萎病菌有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌YBS106的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為棉花枯萎病的防治提供新的方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

S. marcescens YBS106由本課題組從A. erubescen中分離獲得，棉花枯萎病致病菌（F. oxysporum）從感病棉花植株中分離獲得。

1.2 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基NA、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基NB、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PDA和葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基配方參考《植病研究法》[4]。

1.3 菌種培養(yǎng)方法及拮抗活性測(cè)定

拮抗細(xì)菌的發(fā)酵培養(yǎng)：先將保存在斜面上的菌種接入NA培養(yǎng)基平板表面進(jìn)行活化，然后將其接入到裝有100 ml作為種子培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中，在30℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min條件下培養(yǎng)72 h，再將然后將種子液按1%的接種量轉(zhuǎn)接到10個(gè)裝有100 mlNB培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中，以200 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)72 h。

病原菌平板的制備：用打孔器從培養(yǎng)5 d的棉花枯萎病菌平板上打成直徑0.8 mm的菌餅，接到PDA培養(yǎng)的平板上，28℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。

抑菌活性的測(cè)定：采用標(biāo)準(zhǔn)杯碟法[4]測(cè)定拮抗菌的抑菌率。將培養(yǎng)48 h的長(zhǎng)有棉花枯萎病菌的PDA平板上放置牛津杯，向其中加入200 μl細(xì)菌發(fā)酵液，靜置30 min后，置于24℃恒溫箱培養(yǎng)，2 d后觀察抑菌結(jié)果。用直尺測(cè)量棉花枯萎病原菌直徑，以自然生長(zhǎng)的枯萎病原菌為對(duì)照，按照兩者比例的大小來(lái)比較抑菌活性的大小：內(nèi)生細(xì)菌對(duì)棉花枯萎病菌的相對(duì)抑菌率計(jì)算如下：相對(duì)抑菌率=（對(duì)照組病原真菌直徑-試驗(yàn)組病原真菌直徑）/對(duì)照組病原真菌直徑×100%[5]。

1.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定及接種量、最佳發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：用比濁法[6]測(cè)出最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果顯示在540 nm有最大吸收。準(zhǔn)確吸取培養(yǎng)24 h的YBS106培養(yǎng)液5ml，注入到含有100ml種子培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中，振蕩并充分搖勻，每隔2 h取少許發(fā)酵液，并用無(wú)菌水稀釋10倍，用分光光度計(jì)測(cè)量其光密度值OD540[7]。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD540值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。endprint

最佳接種量的選擇：將接種量（體積分?jǐn)?shù)）分別調(diào)節(jié)為1%、2%、4%、5%、6%、8%，分別接入到液體葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)1 d，再用杯碟法測(cè)定發(fā)酵液抑菌率。

最佳發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化：將YBS106菌懸液以2%接種量接種到液體葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基中，在pH為7.0，28℃，條件下培養(yǎng)，每隔12 h取樣再用杯碟法測(cè)定發(fā)酵液抑菌率[8]。

1.5 最佳培養(yǎng)條件篩選

培養(yǎng)基初始pH分別為5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0，每個(gè)梯度設(shè)三個(gè)重復(fù)；培養(yǎng)溫度分別為20℃、25℃、28℃、32℃、37℃、42℃下恒溫培養(yǎng)72 h，每個(gè)溫度設(shè)三個(gè)重復(fù)；搖床轉(zhuǎn)速分別為120、150、180、210、240 r·min-1，每個(gè)梯度設(shè)三個(gè)重復(fù)。分別進(jìn)行溫度、培養(yǎng)基初始pH和搖床轉(zhuǎn)速單因素試驗(yàn)[10]培養(yǎng)YBS106，采用標(biāo)準(zhǔn)杯碟法測(cè)定不同培養(yǎng)條件下拮抗菌的抑菌活性，在培養(yǎng)48 h的長(zhǎng)有棉花枯萎病菌的PDA平板上放置牛津杯，向其中加入200μl細(xì)菌發(fā)酵液，靜置30min后，置于24℃恒溫箱培養(yǎng)，2 d后觀察抑菌結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始條件的選擇

菌株YBS106菌液的吸光度值隨時(shí)間變化的趨勢(shì)與發(fā)酵產(chǎn)物的積累有一定的正相關(guān)系，將吸光度值與發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y=0.1202x+0.41，可以用菌液的吸光度值來(lái)表示該菌株的生長(zhǎng)曲線，根據(jù)其變化值判斷菌體的生長(zhǎng)階段，掌握控制發(fā)酵時(shí)間。拮抗細(xì)菌YBS106生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。由圖1可以看出菌株YBS106的生長(zhǎng)曲線較明顯地分為以下四個(gè)階段：調(diào)整期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期、衰亡期。3～15 h的種子培養(yǎng)液正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，這時(shí)菌體生長(zhǎng)速率最快，最適于作為種子液，適宜選用12～15 h的發(fā)酵液作為種子液。

接種量對(duì)抑菌活性有一定影響，隨著接種量的增加，抑菌活性先提高，之后逐漸趨于平穩(wěn)，接種量在4%以上效果不顯著（見(jiàn)圖2）。

發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌活性有一定影響，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，抑菌活性先升高，發(fā)酵72 h后抑菌活性趨于平穩(wěn)，之后菌液抑菌效果不顯著（圖3）。

2.2 最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化

培養(yǎng)基初始pH：pH是影響YBS106生長(zhǎng)的重要因素，在實(shí)驗(yàn)的pH范圍內(nèi)，隨著pH的上升，抑菌活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)pH在6.5～7.5之間生長(zhǎng)良好，當(dāng)pH達(dá)到7.0附近時(shí)活性最高，之后隨著pH上升，活性開(kāi)始下降（見(jiàn)圖4）。

培養(yǎng)溫度：培養(yǎng)溫度也是影響YBS106生長(zhǎng)的重要因素，隨著實(shí)驗(yàn)溫度的上升，抑菌活性逐漸提高，到28°C附近時(shí)抑菌活性最高，之后隨著溫度的升高，抑菌活性逐漸降低（見(jiàn)圖5）。

搖床轉(zhuǎn)速：搖床轉(zhuǎn)速對(duì)YBS106的生長(zhǎng)也有影響，在設(shè)定的搖床范圍內(nèi)當(dāng)揺床轉(zhuǎn)數(shù)為210 r/min左右時(shí)，抑菌活性相對(duì)較高（見(jiàn)圖6）。進(jìn)一步將搖床轉(zhuǎn)速調(diào)整為190、200、210、220、230 r/min，結(jié)果表明當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，抑菌活性最高（見(jiàn)圖7）。

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，YBS106的最佳發(fā)酵條件為初始pH7.0，28°C左右，發(fā)酵72 h，接種量4%，揺床轉(zhuǎn)速為200 r/min。在此條件下測(cè)試對(duì)抑菌活性的影響，抑菌率為56%。

3 結(jié)論與討論

本研究選取抑菌效果較好的YBS106作為實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)抗菌物質(zhì)產(chǎn)生條件進(jìn)行了初步摸索。通過(guò)對(duì)該菌生長(zhǎng)曲線的研究表明，3～15 h的種子培養(yǎng)基正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，最適于做種子液。并且通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基、發(fā)酵時(shí)間及發(fā)酵溫度幾個(gè)條件的研究發(fā)現(xiàn)，YBS106在培養(yǎng)基中28℃搖床恒溫培養(yǎng)48h后抑菌效果最好。另外通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基的初始pH進(jìn)行調(diào)節(jié)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的初始pH也會(huì)對(duì)抑菌效果產(chǎn)生重要影響。初始pH在中性條件下抑菌效果最好，強(qiáng)酸強(qiáng)堿都會(huì)導(dǎo)致抑菌效果的下降。這一結(jié)果以期為菌株YBS106的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 沈其益.棉花病害基礎(chǔ)研究與防治[M].北京：科學(xué)出版社，1992.

[2] 張穎，王剛，郭建偉，等.利用小麥內(nèi)生細(xì)菌防治小麥全蝕病的初步研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，2007，37（1）：105-108.

[3] 俞俊棠，唐孝宣.生物工藝學(xué)（上冊(cè)）[M].上海：華東化工學(xué)院出版社，1991：96-99.

[4] 方中達(dá).植病研究法[M].3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[5] 程麗娟，薛泉宏.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].西安：世界圖書(shū)出版公司，2000.

[6] 龔明福，林世利，馬玉紅，等.拮抗棉花枯萎病菌的苦豆子內(nèi)生細(xì)菌資源[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，46（3）：531-535.

[7] 馬茜.硫酸鋇吸光比濁法測(cè)定大蒜中大蒜素含量.光譜實(shí)驗(yàn)室[J].2007，24（3）：345-347.

[8] 周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京：高等教育出版社，2006：78-82.

[9] 王瑞霞，張兆紅，劉玉霞，等.枯草芽孢桿菌B-903最佳發(fā)酵時(shí)間研究[J]。河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（3）：46-48.

[10] 杜榮騫.生物統(tǒng)計(jì)學(xué)[M].2版.北京：高等教育出版社，2003，275.

[11] 夏振遠(yuǎn)，郭端強(qiáng)，李銘剛，等.產(chǎn)環(huán)己酰亞胺菌株YM41004發(fā)酵條件的研究[J].工業(yè)微生物，2005，35（2）：37-40.endprint

最佳接種量的選擇：將接種量（體積分?jǐn)?shù)）分別調(diào)節(jié)為1%、2%、4%、5%、6%、8%，分別接入到液體葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)1 d，再用杯碟法測(cè)定發(fā)酵液抑菌率。

最佳發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化：將YBS106菌懸液以2%接種量接種到液體葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基中，在pH為7.0，28℃，條件下培養(yǎng)，每隔12 h取樣再用杯碟法測(cè)定發(fā)酵液抑菌率[8]。

1.5 最佳培養(yǎng)條件篩選

培養(yǎng)基初始pH分別為5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0，每個(gè)梯度設(shè)三個(gè)重復(fù)；培養(yǎng)溫度分別為20℃、25℃、28℃、32℃、37℃、42℃下恒溫培養(yǎng)72 h，每個(gè)溫度設(shè)三個(gè)重復(fù)；搖床轉(zhuǎn)速分別為120、150、180、210、240 r·min-1，每個(gè)梯度設(shè)三個(gè)重復(fù)。分別進(jìn)行溫度、培養(yǎng)基初始pH和搖床轉(zhuǎn)速單因素試驗(yàn)[10]培養(yǎng)YBS106，采用標(biāo)準(zhǔn)杯碟法測(cè)定不同培養(yǎng)條件下拮抗菌的抑菌活性，在培養(yǎng)48 h的長(zhǎng)有棉花枯萎病菌的PDA平板上放置牛津杯，向其中加入200μl細(xì)菌發(fā)酵液，靜置30min后，置于24℃恒溫箱培養(yǎng)，2 d后觀察抑菌結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始條件的選擇

菌株YBS106菌液的吸光度值隨時(shí)間變化的趨勢(shì)與發(fā)酵產(chǎn)物的積累有一定的正相關(guān)系，將吸光度值與發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y=0.1202x+0.41，可以用菌液的吸光度值來(lái)表示該菌株的生長(zhǎng)曲線，根據(jù)其變化值判斷菌體的生長(zhǎng)階段，掌握控制發(fā)酵時(shí)間。拮抗細(xì)菌YBS106生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。由圖1可以看出菌株YBS106的生長(zhǎng)曲線較明顯地分為以下四個(gè)階段：調(diào)整期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期、衰亡期。3～15 h的種子培養(yǎng)液正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，這時(shí)菌體生長(zhǎng)速率最快，最適于作為種子液，適宜選用12～15 h的發(fā)酵液作為種子液。

接種量對(duì)抑菌活性有一定影響，隨著接種量的增加，抑菌活性先提高，之后逐漸趨于平穩(wěn)，接種量在4%以上效果不顯著（見(jiàn)圖2）。

發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌活性有一定影響，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，抑菌活性先升高，發(fā)酵72 h后抑菌活性趨于平穩(wěn)，之后菌液抑菌效果不顯著（圖3）。

2.2 最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化

培養(yǎng)基初始pH：pH是影響YBS106生長(zhǎng)的重要因素，在實(shí)驗(yàn)的pH范圍內(nèi)，隨著pH的上升，抑菌活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)pH在6.5～7.5之間生長(zhǎng)良好，當(dāng)pH達(dá)到7.0附近時(shí)活性最高，之后隨著pH上升，活性開(kāi)始下降（見(jiàn)圖4）。

培養(yǎng)溫度：培養(yǎng)溫度也是影響YBS106生長(zhǎng)的重要因素，隨著實(shí)驗(yàn)溫度的上升，抑菌活性逐漸提高，到28°C附近時(shí)抑菌活性最高，之后隨著溫度的升高，抑菌活性逐漸降低（見(jiàn)圖5）。

搖床轉(zhuǎn)速：搖床轉(zhuǎn)速對(duì)YBS106的生長(zhǎng)也有影響，在設(shè)定的搖床范圍內(nèi)當(dāng)揺床轉(zhuǎn)數(shù)為210 r/min左右時(shí)，抑菌活性相對(duì)較高（見(jiàn)圖6）。進(jìn)一步將搖床轉(zhuǎn)速調(diào)整為190、200、210、220、230 r/min，結(jié)果表明當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，抑菌活性最高（見(jiàn)圖7）。

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，YBS106的最佳發(fā)酵條件為初始pH7.0，28°C左右，發(fā)酵72 h，接種量4%，揺床轉(zhuǎn)速為200 r/min。在此條件下測(cè)試對(duì)抑菌活性的影響，抑菌率為56%。

3 結(jié)論與討論

本研究選取抑菌效果較好的YBS106作為實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)抗菌物質(zhì)產(chǎn)生條件進(jìn)行了初步摸索。通過(guò)對(duì)該菌生長(zhǎng)曲線的研究表明，3～15 h的種子培養(yǎng)基正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，最適于做種子液。并且通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基、發(fā)酵時(shí)間及發(fā)酵溫度幾個(gè)條件的研究發(fā)現(xiàn)，YBS106在培養(yǎng)基中28℃搖床恒溫培養(yǎng)48h后抑菌效果最好。另外通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基的初始pH進(jìn)行調(diào)節(jié)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的初始pH也會(huì)對(duì)抑菌效果產(chǎn)生重要影響。初始pH在中性條件下抑菌效果最好，強(qiáng)酸強(qiáng)堿都會(huì)導(dǎo)致抑菌效果的下降。這一結(jié)果以期為菌株YBS106的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 沈其益.棉花病害基礎(chǔ)研究與防治[M].北京：科學(xué)出版社，1992.

[2] 張穎，王剛，郭建偉，等.利用小麥內(nèi)生細(xì)菌防治小麥全蝕病的初步研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，2007，37（1）：105-108.

[3] 俞俊棠，唐孝宣.生物工藝學(xué)（上冊(cè)）[M].上海：華東化工學(xué)院出版社，1991：96-99.

[4] 方中達(dá).植病研究法[M].3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[5] 程麗娟，薛泉宏.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].西安：世界圖書(shū)出版公司，2000.

[6] 龔明福，林世利，馬玉紅，等.拮抗棉花枯萎病菌的苦豆子內(nèi)生細(xì)菌資源[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，46（3）：531-535.

[7] 馬茜.硫酸鋇吸光比濁法測(cè)定大蒜中大蒜素含量.光譜實(shí)驗(yàn)室[J].2007，24（3）：345-347.

[8] 周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京：高等教育出版社，2006：78-82.

[9] 王瑞霞，張兆紅，劉玉霞，等.枯草芽孢桿菌B-903最佳發(fā)酵時(shí)間研究[J]。河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（3）：46-48.

[10] 杜榮騫.生物統(tǒng)計(jì)學(xué)[M].2版.北京：高等教育出版社，2003，275.

[11] 夏振遠(yuǎn)，郭端強(qiáng)，李銘剛，等.產(chǎn)環(huán)己酰亞胺菌株YM41004發(fā)酵條件的研究[J].工業(yè)微生物，2005，35（2）：37-40.endprint

最佳接種量的選擇：將接種量（體積分?jǐn)?shù)）分別調(diào)節(jié)為1%、2%、4%、5%、6%、8%，分別接入到液體葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)1 d，再用杯碟法測(cè)定發(fā)酵液抑菌率。

最佳發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化：將YBS106菌懸液以2%接種量接種到液體葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基中，在pH為7.0，28℃，條件下培養(yǎng)，每隔12 h取樣再用杯碟法測(cè)定發(fā)酵液抑菌率[8]。

1.5 最佳培養(yǎng)條件篩選

培養(yǎng)基初始pH分別為5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0，每個(gè)梯度設(shè)三個(gè)重復(fù)；培養(yǎng)溫度分別為20℃、25℃、28℃、32℃、37℃、42℃下恒溫培養(yǎng)72 h，每個(gè)溫度設(shè)三個(gè)重復(fù)；搖床轉(zhuǎn)速分別為120、150、180、210、240 r·min-1，每個(gè)梯度設(shè)三個(gè)重復(fù)。分別進(jìn)行溫度、培養(yǎng)基初始pH和搖床轉(zhuǎn)速單因素試驗(yàn)[10]培養(yǎng)YBS106，采用標(biāo)準(zhǔn)杯碟法測(cè)定不同培養(yǎng)條件下拮抗菌的抑菌活性，在培養(yǎng)48 h的長(zhǎng)有棉花枯萎病菌的PDA平板上放置牛津杯，向其中加入200μl細(xì)菌發(fā)酵液，靜置30min后，置于24℃恒溫箱培養(yǎng)，2 d后觀察抑菌結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始條件的選擇

菌株YBS106菌液的吸光度值隨時(shí)間變化的趨勢(shì)與發(fā)酵產(chǎn)物的積累有一定的正相關(guān)系，將吸光度值與發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y=0.1202x+0.41，可以用菌液的吸光度值來(lái)表示該菌株的生長(zhǎng)曲線，根據(jù)其變化值判斷菌體的生長(zhǎng)階段，掌握控制發(fā)酵時(shí)間。拮抗細(xì)菌YBS106生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。由圖1可以看出菌株YBS106的生長(zhǎng)曲線較明顯地分為以下四個(gè)階段：調(diào)整期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期、衰亡期。3～15 h的種子培養(yǎng)液正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，這時(shí)菌體生長(zhǎng)速率最快，最適于作為種子液，適宜選用12～15 h的發(fā)酵液作為種子液。

接種量對(duì)抑菌活性有一定影響，隨著接種量的增加，抑菌活性先提高，之后逐漸趨于平穩(wěn)，接種量在4%以上效果不顯著（見(jiàn)圖2）。

發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌活性有一定影響，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，抑菌活性先升高，發(fā)酵72 h后抑菌活性趨于平穩(wěn)，之后菌液抑菌效果不顯著（圖3）。

2.2 最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化

培養(yǎng)基初始pH：pH是影響YBS106生長(zhǎng)的重要因素，在實(shí)驗(yàn)的pH范圍內(nèi)，隨著pH的上升，抑菌活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)pH在6.5～7.5之間生長(zhǎng)良好，當(dāng)pH達(dá)到7.0附近時(shí)活性最高，之后隨著pH上升，活性開(kāi)始下降（見(jiàn)圖4）。

培養(yǎng)溫度：培養(yǎng)溫度也是影響YBS106生長(zhǎng)的重要因素，隨著實(shí)驗(yàn)溫度的上升，抑菌活性逐漸提高，到28°C附近時(shí)抑菌活性最高，之后隨著溫度的升高，抑菌活性逐漸降低（見(jiàn)圖5）。

搖床轉(zhuǎn)速：搖床轉(zhuǎn)速對(duì)YBS106的生長(zhǎng)也有影響，在設(shè)定的搖床范圍內(nèi)當(dāng)揺床轉(zhuǎn)數(shù)為210 r/min左右時(shí)，抑菌活性相對(duì)較高（見(jiàn)圖6）。進(jìn)一步將搖床轉(zhuǎn)速調(diào)整為190、200、210、220、230 r/min，結(jié)果表明當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，抑菌活性最高（見(jiàn)圖7）。

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，YBS106的最佳發(fā)酵條件為初始pH7.0，28°C左右，發(fā)酵72 h，接種量4%，揺床轉(zhuǎn)速為200 r/min。在此條件下測(cè)試對(duì)抑菌活性的影響，抑菌率為56%。

3 結(jié)論與討論

本研究選取抑菌效果較好的YBS106作為實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)抗菌物質(zhì)產(chǎn)生條件進(jìn)行了初步摸索。通過(guò)對(duì)該菌生長(zhǎng)曲線的研究表明，3～15 h的種子培養(yǎng)基正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，最適于做種子液。并且通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基、發(fā)酵時(shí)間及發(fā)酵溫度幾個(gè)條件的研究發(fā)現(xiàn)，YBS106在培養(yǎng)基中28℃搖床恒溫培養(yǎng)48h后抑菌效果最好。另外通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基的初始pH進(jìn)行調(diào)節(jié)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的初始pH也會(huì)對(duì)抑菌效果產(chǎn)生重要影響。初始pH在中性條件下抑菌效果最好，強(qiáng)酸強(qiáng)堿都會(huì)導(dǎo)致抑菌效果的下降。這一結(jié)果以期為菌株YBS106的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 沈其益.棉花病害基礎(chǔ)研究與防治[M].北京：科學(xué)出版社，1992.

[2] 張穎，王剛，郭建偉，等.利用小麥內(nèi)生細(xì)菌防治小麥全蝕病的初步研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，2007，37（1）：105-108.

[3] 俞俊棠，唐孝宣.生物工藝學(xué)（上冊(cè)）[M].上海：華東化工學(xué)院出版社，1991：96-99.

[4] 方中達(dá).植病研究法[M].3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[5] 程麗娟，薛泉宏.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].西安：世界圖書(shū)出版公司，2000.

[6] 龔明福，林世利，馬玉紅，等.拮抗棉花枯萎病菌的苦豆子內(nèi)生細(xì)菌資源[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，46（3）：531-535.

[7] 馬茜.硫酸鋇吸光比濁法測(cè)定大蒜中大蒜素含量.光譜實(shí)驗(yàn)室[J].2007，24（3）：345-347.

[8] 周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京：高等教育出版社，2006：78-82.

[9] 王瑞霞，張兆紅，劉玉霞，等.枯草芽孢桿菌B-903最佳發(fā)酵時(shí)間研究[J]。河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（3）：46-48.

[10] 杜榮騫.生物統(tǒng)計(jì)學(xué)[M].2版.北京：高等教育出版社，2003，275.

[11] 夏振遠(yuǎn)，郭端強(qiáng)，李銘剛，等.產(chǎn)環(huán)己酰亞胺菌株YM41004發(fā)酵條件的研究[J].工業(yè)微生物，2005，35（2）：37-40.endprint