腈基類化合物對(duì)半胱氨酸蛋白酶的抑制機(jī)理

趙云飛

摘 要：半胱氨酸蛋白酶是人體自身產(chǎn)生的重要酶類物質(zhì)，它廣泛的參與人體新陳代謝和蛋白的水解。但過(guò)量產(chǎn)生的半胱氨酸蛋白酶會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和乳腺癌。腈基類化合物分子是一種新發(fā)現(xiàn)的具有抑制半胱氨酸蛋白酶作用的靶向藥物分子，高效且低副作用。但是它的抑制機(jī)理一直沒(méi)有得到解決。本文介紹借助量子力學(xué)/分子力學(xué)（QM/MM）的計(jì)算研究，解得了此類化合物對(duì)于半胱氨酸蛋白酶的抑制機(jī)理，并借助分子學(xué)軟件設(shè)計(jì)了一種新型藥物分子，有助進(jìn)一步藥物研究。

關(guān)鍵詞：半胱氨酸蛋白酶 組織蛋白酶K 量子力學(xué)/分子力學(xué)（QM/MM）

中圖分類號(hào)：R969.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2014）04（b）-0097-04

The Mechanism of Inhibition of Cysteine Protease

ZHAO Yunfei

（School of Life Science， Tsinghua University， Beijing）

Abstract： Cysteine protease is a vital enzyme for human metabolism and involved in a proteolysis reaction in human body. However， over-expressed cysteine proteases can cause serious diseases such as osteoporosis and breast cancer. Nitrile-based inhibitors are newly-discovered substrates as well as drugs which can inhibit cysteine proteases with high efficiency and low side-effects. However， the mechanism of inhibition remains unknown. This paper illustrates a novel computational calculation performed by quantum mechanics/molecular mechanics （QM/MM） to resolve this mechanism. We find a stepwise mechanism whereby the deprotonated anionic sulfur atom from cysteine of the active site of Cathepsin K attacks a nitrile containing substrate to form an intermediate structure， followed by a deprotonation reaction to form a lower energy product state structure， and therefore， this mechanism of inhibition of cysteine protease has been resolved.

Keywords： Cysteine protease Cathepsin K quantum mechanics/molecular mechanics （QM/MM）

1 概況

半胱氨酸酶作為六大酶類之一，廣泛存在于各種生物有機(jī)體內(nèi)，如病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物、植物和哺乳動(dòng)物[1]，主要參與人體新陳代謝和蛋白質(zhì)的水解。近年來(lái)，人類成功的從植物中提取出半胱氨酸酶作為藥物治療腸內(nèi)蠕蟲(chóng)的感染[2]。它對(duì)結(jié)籽期內(nèi)植物的生長(zhǎng)和人類骨骼的發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。

半胱氨酸酶的蛋白質(zhì)水解途徑如圖1所示。它的催化位點(diǎn)由一個(gè)帶硫基的半胱氨酸基團(tuán)和一個(gè)組氨酸基團(tuán)組成[3]。盡管蛋白質(zhì)的水解過(guò)程是不可逆的，但在一些特定的條件下，蛋白質(zhì)會(huì)通過(guò)一系列轉(zhuǎn)錄后的修飾，使得原先的不可逆變成可逆。

組織蛋白酶是半胱氨酸酶家族中的一類，可細(xì)分成組織蛋白酶B、C、F、H、K、L1、O、S、W和Z。組織蛋白酶K將作為半胱氨酸酸酶的代表被本文所研究，因?yàn)槠渲饕獏⑴c了人體的骨吸收作用[4]并首次發(fā)現(xiàn)于兔子的破骨細(xì)胞中，且同樣大量產(chǎn)生于人體的破骨細(xì)胞。過(guò)程如圖2所示。

組織蛋白酶K的功能在于通過(guò)水解人體膠原蛋白和彈性蛋白達(dá)到骨質(zhì)破壞的作用，此功能在人體骨骼生長(zhǎng)時(shí)起著至關(guān)重要的作用。組織蛋白酶K的缺失會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)的脆性增大，病人容易患致密性成骨不全癥[5]。相反，過(guò)量的產(chǎn)生組織蛋白酶K會(huì)侵蝕骨基質(zhì)蛋白，如骨橋蛋白、骨粘連蛋白、膠原蛋白I和II，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松[6]。同時(shí)，過(guò)量的組織蛋白酶K會(huì)大大增加得乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，并因此血液中組織蛋白酶K濃度的檢測(cè)已作為診斷乳腺癌的重要指標(biāo)之一，因?yàn)槠乒羌?xì)胞對(duì)膠原蛋白的破壞有助于癌細(xì)胞的增長(zhǎng)和擴(kuò)散[7]且乳腺癌細(xì)胞也能夠大量產(chǎn)生過(guò)量的組織蛋白酶K。

2 理論與模型

以前的化學(xué)家利用塑料制的棍子來(lái)為自己搭建化學(xué)分子式的3D模型。如今我們利用基于經(jīng)典物理學(xué)和量子力學(xué)原理的軟件來(lái)設(shè)計(jì)最優(yōu)化的分子結(jié)構(gòu)模型，例如一個(gè)化學(xué)分子中鍵與鍵之間的夾角，以及原子與原子之間的距離，都可以通過(guò)計(jì)算使得分子的空間結(jié)構(gòu)最優(yōu)化（分子結(jié)構(gòu)式能量最低）。計(jì)算機(jī)模型的介入對(duì)于我們研究反應(yīng)速度極快的酶反應(yīng)過(guò)程中的不穩(wěn)定中間體和過(guò)度狀態(tài)帶來(lái)巨大的幫助，因?yàn)榈侥壳盀橹?，?duì)于酶反應(yīng)過(guò)程中的中間體的分子3D結(jié)構(gòu)，在實(shí)驗(yàn)室條件下還無(wú)法觀測(cè)。

分子力學(xué)（MM）是基于經(jīng)典物理學(xué)的理論，用于闡述分子結(jié)構(gòu)式的空間結(jié)構(gòu)和分子勢(shì)能的計(jì)算。在MM的計(jì)算原理中，因?yàn)樗雎粤朔肿酉到y(tǒng)中電子和原子核之間的相互作用，所以它不能夠用于計(jì)算化學(xué)反應(yīng)中有鍵與鍵的斷裂或形成的分子勢(shì)能。但是它仍然可以精確的計(jì)算出大分子量（由上千原子組成）的分子結(jié)構(gòu)式。endprint

量子力學(xué)（QM）相對(duì)于分子力學(xué)而言，它更側(cè)重于計(jì)算出電子和原子核之間的相互作用力。量子力學(xué)/分子力學(xué)（QM/MM）的計(jì)算方法則可以精確的計(jì)算出酶分子在反應(yīng)過(guò)程中任意階段的分子勢(shì)能的變化。因?yàn)樗鼘⒚阜肿拥膭?shì)能分開(kāi)單獨(dú)計(jì)算，活性催化位點(diǎn)（反應(yīng)過(guò)程中包含大量分子鍵的斷裂和形成，原子數(shù)量一般在60個(gè)左右）利用QM來(lái)計(jì)算，而其余惰性分子區(qū)域（包括包裹在酶分子周圍的水分子）則采用MM計(jì)算方法。

目前，半胱氨酸抑制劑主要可分為羰基類化合物、腈基類化合物和其它與半胱氨酸酶非共價(jià)結(jié)合類抑制物。半胱氨酸酶抑制劑的發(fā)展史可以被認(rèn)為是與半胱氨酸酶的不可逆結(jié)合到可逆結(jié)合。盡管非共價(jià)結(jié)合抑制物已經(jīng)被廣泛發(fā)現(xiàn)，但大多數(shù)都屬于多肽大分子化合物，由于它們的大分子量和大體積以至于它們的抑制效果非常不好。不可逆結(jié)合類抑制物曾在過(guò)去一段時(shí)間內(nèi)非常流行，因?yàn)榇祟惢衔锞哂袠O強(qiáng)的靶向型并被多篇研究報(bào)道以及市場(chǎng)化。然而近期我們發(fā)現(xiàn)此類藥物在長(zhǎng)期服用的情況下會(huì)導(dǎo)致免疫性和抗原性的并發(fā)癥。所以，研究人員越來(lái)越傾向于研究新型的小分子可逆抑制型化合物。

腈基類化合物作為小分子、共價(jià)結(jié)合類抑制劑具有極為優(yōu)越的高效、低毒效果受到人們青睞，但其抑制機(jī)理從未被揭示。本研究將利用計(jì)算機(jī)模型計(jì)算的方法，證實(shí)我們假設(shè)的腈基類化合物的抑制機(jī)理的可行性（圖3所示）。

3 結(jié)論

我們通過(guò)對(duì)腈基類化合物與組織蛋白酶K的結(jié)合物系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，得到的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)（QM部分）如圖4所示；能量掃描結(jié)構(gòu)圖像如圖5所示。

通過(guò)對(duì)圖5所得到的結(jié)構(gòu)能量掃描圖的分析，其符合生化反應(yīng)的能量變化規(guī)律。且我們通過(guò)QM/MM計(jì)算方式，系統(tǒng)成功的得到我們想要的最優(yōu)化的系統(tǒng)反應(yīng)中間態(tài)。充分證明了我們?cè)O(shè)想的腈基類化合物的抑制機(jī)理的可行性（圖3）。其中我們?cè)O(shè)計(jì)的新型腈基類抑制底物具有臨床研究?jī)r(jià)值。

4 實(shí)驗(yàn)部分

首先，我們使用Gaussian View軟件去設(shè)計(jì)最初的一種腈基類抑制化合物，再通過(guò)UB3LYP（6-31G）計(jì)算程序?qū)衔锓肿咏Y(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化前后的分子空間結(jié)構(gòu)如圖6所示。我們發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的分子能量（kcal mol-1）比優(yōu)化前低（ΔE= -1838.6），說(shuō)明優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)比優(yōu)化前穩(wěn)定的多。

其次，我們從PDB文件（1U9V）中刪除原先的抑制分子IHE，利用Chimera軟件將新設(shè)計(jì)的化合物底物插入到原先IHE分子的位置，堵住組織蛋白酶K的催化位點(diǎn)（由CYS 25和HIS 162組成）（圖7）。基于QM/MM的理論，利用Multilayer Onion Model計(jì)算方法我們將CYS 25中的硫原子設(shè)為中心點(diǎn)，與之長(zhǎng)度為8 Angstroms的空間內(nèi)包含的所有原子設(shè)定為QM區(qū)域，共有底物、HIS 162、CYS 25、ALA 163、GLY 64和GLY 65包含在QM區(qū)域內(nèi)。其余都設(shè)定為MM區(qū)域（包含3160個(gè)原子）。用程序UB3LYP（6-31G）優(yōu)化QM區(qū)域。用程序UFF優(yōu)化MM區(qū)域。再利用CHARMM軟件向最新優(yōu)化后的PDB文件中加入水分子，將整個(gè)體系包含在直徑為60 Angstroms的水球內(nèi)，如圖8所示。

最后，我們將加入水分子后的大系統(tǒng)通過(guò)之前同樣的Multilayer Onion Model計(jì)算方法將系統(tǒng)結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到最終的能量最低的產(chǎn)物狀態(tài)（C），隨后我們依照?qǐng)D3的反應(yīng)式往回通過(guò)掃描式計(jì)算的方法得到中間態(tài)的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。首先，我們切斷帶有腈基集團(tuán)底物上的N-H鍵，并同時(shí)縮小H 3248和與之相鄰的組氨酸集團(tuán)（HIS 162）的N 2361之間的距離，通過(guò)輸入指令：

3248 2361 S 10 -0.05

表明我們?nèi)藶橥ㄟ^(guò)10個(gè)反應(yīng)步驟（步步使用Multilayer Onion Model計(jì)算方法進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化）縮小H 3248和N 2361的距離，每一步的縮小距離是0.05 angstroms。我們得到掃描式計(jì)算中能量最高點(diǎn)的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)（TSB）和能量最低點(diǎn)的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)（B）。所有原子的數(shù)值標(biāo)記都根據(jù)原始GJF文件。

我們隨之將系統(tǒng)結(jié)構(gòu)B依照?qǐng)D三的反應(yīng)式繼續(xù)往回通過(guò)同樣的掃描計(jì)算式方法，首先切斷中間底物（腈基化合物）的C-S鍵，并同時(shí)增大S 367與之相鄰的半胱氨酸基團(tuán)（CYS 25）的C 3249之間的距離，通過(guò)輸入指令：

3249 367 S 10 0.1

表明我們?nèi)藶橥ㄟ^(guò)10個(gè)反應(yīng)步驟（步步使用Multilayer Onion Model計(jì)算方法進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化）增加S 367和C 3249的距離，每一步的增加距離是0.1 angstroms。

最終，我們從結(jié)合物C逆計(jì)算得到產(chǎn)物A、TSA、B、TSB的結(jié)構(gòu)如圖9所示。

參考文獻(xiàn)

[1] Barrett， A. In Proteinase Inhibitors； Barrett， A.， Salvesen， G.， Eds.； Elsevier： Amsterdam， 1986-3-22.

[2] Sharma， A.； Padwal-Desai， S.； Ninjoor， V. Biochem. Biophys.， Res. Commun. 1989， 159， 464-471.Scottk. Thompson， Stacie M. Halbert， Mary J. Bossard[J].Proc， Natl. Acad， Sci， USA， 1997，94：14249-14254.

[3]Garnero P， Sornary-Rendu E， Chapuy MC， Delmas PD. J. Bone Miner Res. 1996； 11： 337-49.Andrew D. Morley， Peter W. Kenny[J].Bioorg. Med. Chem. Lett.，2009，19：1658-1661.

[4] Le Gall C， Bellahcene A， Bonnelve E， Cancer Res[J].2007，67（20）： 9894-902.

[5] Jiaqiang Cai，Craig Jamieson， Jennifer Moir，et al.Cathepsin K inhibitors，2000-2004，Expert. Opin.Ther[J].2005，15（1）：33-48.

[6] Eva Altmann.2-Cyano-pyrimidines：A New Chemotype for Inhibitors of the Cysteine Protease Cathepsin K[J].Journal of Medicinal Chemistry，2007， 50（4）：591-594.

[7] Philip A.MacFaul，Andrew D.Morley，James J.Crawford.A simple in vitro assay for assessing the reactivity of nitrile containing compounds[J].Bioorg.Med.Chem.Lett.2009，19：1136-1138.endprint

量子力學(xué)（QM）相對(duì)于分子力學(xué)而言，它更側(cè)重于計(jì)算出電子和原子核之間的相互作用力。量子力學(xué)/分子力學(xué)（QM/MM）的計(jì)算方法則可以精確的計(jì)算出酶分子在反應(yīng)過(guò)程中任意階段的分子勢(shì)能的變化。因?yàn)樗鼘⒚阜肿拥膭?shì)能分開(kāi)單獨(dú)計(jì)算，活性催化位點(diǎn)（反應(yīng)過(guò)程中包含大量分子鍵的斷裂和形成，原子數(shù)量一般在60個(gè)左右）利用QM來(lái)計(jì)算，而其余惰性分子區(qū)域（包括包裹在酶分子周圍的水分子）則采用MM計(jì)算方法。

目前，半胱氨酸抑制劑主要可分為羰基類化合物、腈基類化合物和其它與半胱氨酸酶非共價(jià)結(jié)合類抑制物。半胱氨酸酶抑制劑的發(fā)展史可以被認(rèn)為是與半胱氨酸酶的不可逆結(jié)合到可逆結(jié)合。盡管非共價(jià)結(jié)合抑制物已經(jīng)被廣泛發(fā)現(xiàn)，但大多數(shù)都屬于多肽大分子化合物，由于它們的大分子量和大體積以至于它們的抑制效果非常不好。不可逆結(jié)合類抑制物曾在過(guò)去一段時(shí)間內(nèi)非常流行，因?yàn)榇祟惢衔锞哂袠O強(qiáng)的靶向型并被多篇研究報(bào)道以及市場(chǎng)化。然而近期我們發(fā)現(xiàn)此類藥物在長(zhǎng)期服用的情況下會(huì)導(dǎo)致免疫性和抗原性的并發(fā)癥。所以，研究人員越來(lái)越傾向于研究新型的小分子可逆抑制型化合物。

腈基類化合物作為小分子、共價(jià)結(jié)合類抑制劑具有極為優(yōu)越的高效、低毒效果受到人們青睞，但其抑制機(jī)理從未被揭示。本研究將利用計(jì)算機(jī)模型計(jì)算的方法，證實(shí)我們假設(shè)的腈基類化合物的抑制機(jī)理的可行性（圖3所示）。

3 結(jié)論

我們通過(guò)對(duì)腈基類化合物與組織蛋白酶K的結(jié)合物系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，得到的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)（QM部分）如圖4所示；能量掃描結(jié)構(gòu)圖像如圖5所示。

通過(guò)對(duì)圖5所得到的結(jié)構(gòu)能量掃描圖的分析，其符合生化反應(yīng)的能量變化規(guī)律。且我們通過(guò)QM/MM計(jì)算方式，系統(tǒng)成功的得到我們想要的最優(yōu)化的系統(tǒng)反應(yīng)中間態(tài)。充分證明了我們?cè)O(shè)想的腈基類化合物的抑制機(jī)理的可行性（圖3）。其中我們?cè)O(shè)計(jì)的新型腈基類抑制底物具有臨床研究?jī)r(jià)值。

4 實(shí)驗(yàn)部分

首先，我們使用Gaussian View軟件去設(shè)計(jì)最初的一種腈基類抑制化合物，再通過(guò)UB3LYP（6-31G）計(jì)算程序?qū)衔锓肿咏Y(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化前后的分子空間結(jié)構(gòu)如圖6所示。我們發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的分子能量（kcal mol-1）比優(yōu)化前低（ΔE= -1838.6），說(shuō)明優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)比優(yōu)化前穩(wěn)定的多。

其次，我們從PDB文件（1U9V）中刪除原先的抑制分子IHE，利用Chimera軟件將新設(shè)計(jì)的化合物底物插入到原先IHE分子的位置，堵住組織蛋白酶K的催化位點(diǎn)（由CYS 25和HIS 162組成）（圖7）。基于QM/MM的理論，利用Multilayer Onion Model計(jì)算方法我們將CYS 25中的硫原子設(shè)為中心點(diǎn)，與之長(zhǎng)度為8 Angstroms的空間內(nèi)包含的所有原子設(shè)定為QM區(qū)域，共有底物、HIS 162、CYS 25、ALA 163、GLY 64和GLY 65包含在QM區(qū)域內(nèi)。其余都設(shè)定為MM區(qū)域（包含3160個(gè)原子）。用程序UB3LYP（6-31G）優(yōu)化QM區(qū)域。用程序UFF優(yōu)化MM區(qū)域。再利用CHARMM軟件向最新優(yōu)化后的PDB文件中加入水分子，將整個(gè)體系包含在直徑為60 Angstroms的水球內(nèi)，如圖8所示。

最后，我們將加入水分子后的大系統(tǒng)通過(guò)之前同樣的Multilayer Onion Model計(jì)算方法將系統(tǒng)結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到最終的能量最低的產(chǎn)物狀態(tài)（C），隨后我們依照?qǐng)D3的反應(yīng)式往回通過(guò)掃描式計(jì)算的方法得到中間態(tài)的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。首先，我們切斷帶有腈基集團(tuán)底物上的N-H鍵，并同時(shí)縮小H 3248和與之相鄰的組氨酸集團(tuán)（HIS 162）的N 2361之間的距離，通過(guò)輸入指令：

3248 2361 S 10 -0.05

表明我們?nèi)藶橥ㄟ^(guò)10個(gè)反應(yīng)步驟（步步使用Multilayer Onion Model計(jì)算方法進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化）縮小H 3248和N 2361的距離，每一步的縮小距離是0.05 angstroms。我們得到掃描式計(jì)算中能量最高點(diǎn)的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)（TSB）和能量最低點(diǎn)的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)（B）。所有原子的數(shù)值標(biāo)記都根據(jù)原始GJF文件。

我們隨之將系統(tǒng)結(jié)構(gòu)B依照?qǐng)D三的反應(yīng)式繼續(xù)往回通過(guò)同樣的掃描計(jì)算式方法，首先切斷中間底物（腈基化合物）的C-S鍵，并同時(shí)增大S 367與之相鄰的半胱氨酸基團(tuán)（CYS 25）的C 3249之間的距離，通過(guò)輸入指令：

3249 367 S 10 0.1

表明我們?nèi)藶橥ㄟ^(guò)10個(gè)反應(yīng)步驟（步步使用Multilayer Onion Model計(jì)算方法進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化）增加S 367和C 3249的距離，每一步的增加距離是0.1 angstroms。

最終，我們從結(jié)合物C逆計(jì)算得到產(chǎn)物A、TSA、B、TSB的結(jié)構(gòu)如圖9所示。

參考文獻(xiàn)

[1] Barrett， A. In Proteinase Inhibitors； Barrett， A.， Salvesen， G.， Eds.； Elsevier： Amsterdam， 1986-3-22.

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[5] Jiaqiang Cai，Craig Jamieson， Jennifer Moir，et al.Cathepsin K inhibitors，2000-2004，Expert. Opin.Ther[J].2005，15（1）：33-48.

[6] Eva Altmann.2-Cyano-pyrimidines：A New Chemotype for Inhibitors of the Cysteine Protease Cathepsin K[J].Journal of Medicinal Chemistry，2007， 50（4）：591-594.

[7] Philip A.MacFaul，Andrew D.Morley，James J.Crawford.A simple in vitro assay for assessing the reactivity of nitrile containing compounds[J].Bioorg.Med.Chem.Lett.2009，19：1136-1138.endprint

量子力學(xué)（QM）相對(duì)于分子力學(xué)而言，它更側(cè)重于計(jì)算出電子和原子核之間的相互作用力。量子力學(xué)/分子力學(xué)（QM/MM）的計(jì)算方法則可以精確的計(jì)算出酶分子在反應(yīng)過(guò)程中任意階段的分子勢(shì)能的變化。因?yàn)樗鼘⒚阜肿拥膭?shì)能分開(kāi)單獨(dú)計(jì)算，活性催化位點(diǎn)（反應(yīng)過(guò)程中包含大量分子鍵的斷裂和形成，原子數(shù)量一般在60個(gè)左右）利用QM來(lái)計(jì)算，而其余惰性分子區(qū)域（包括包裹在酶分子周圍的水分子）則采用MM計(jì)算方法。

目前，半胱氨酸抑制劑主要可分為羰基類化合物、腈基類化合物和其它與半胱氨酸酶非共價(jià)結(jié)合類抑制物。半胱氨酸酶抑制劑的發(fā)展史可以被認(rèn)為是與半胱氨酸酶的不可逆結(jié)合到可逆結(jié)合。盡管非共價(jià)結(jié)合抑制物已經(jīng)被廣泛發(fā)現(xiàn)，但大多數(shù)都屬于多肽大分子化合物，由于它們的大分子量和大體積以至于它們的抑制效果非常不好。不可逆結(jié)合類抑制物曾在過(guò)去一段時(shí)間內(nèi)非常流行，因?yàn)榇祟惢衔锞哂袠O強(qiáng)的靶向型并被多篇研究報(bào)道以及市場(chǎng)化。然而近期我們發(fā)現(xiàn)此類藥物在長(zhǎng)期服用的情況下會(huì)導(dǎo)致免疫性和抗原性的并發(fā)癥。所以，研究人員越來(lái)越傾向于研究新型的小分子可逆抑制型化合物。

腈基類化合物作為小分子、共價(jià)結(jié)合類抑制劑具有極為優(yōu)越的高效、低毒效果受到人們青睞，但其抑制機(jī)理從未被揭示。本研究將利用計(jì)算機(jī)模型計(jì)算的方法，證實(shí)我們假設(shè)的腈基類化合物的抑制機(jī)理的可行性（圖3所示）。

3 結(jié)論

我們通過(guò)對(duì)腈基類化合物與組織蛋白酶K的結(jié)合物系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，得到的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)（QM部分）如圖4所示；能量掃描結(jié)構(gòu)圖像如圖5所示。

通過(guò)對(duì)圖5所得到的結(jié)構(gòu)能量掃描圖的分析，其符合生化反應(yīng)的能量變化規(guī)律。且我們通過(guò)QM/MM計(jì)算方式，系統(tǒng)成功的得到我們想要的最優(yōu)化的系統(tǒng)反應(yīng)中間態(tài)。充分證明了我們?cè)O(shè)想的腈基類化合物的抑制機(jī)理的可行性（圖3）。其中我們?cè)O(shè)計(jì)的新型腈基類抑制底物具有臨床研究?jī)r(jià)值。

4 實(shí)驗(yàn)部分

首先，我們使用Gaussian View軟件去設(shè)計(jì)最初的一種腈基類抑制化合物，再通過(guò)UB3LYP（6-31G）計(jì)算程序?qū)衔锓肿咏Y(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化前后的分子空間結(jié)構(gòu)如圖6所示。我們發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的分子能量（kcal mol-1）比優(yōu)化前低（ΔE= -1838.6），說(shuō)明優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)比優(yōu)化前穩(wěn)定的多。

其次，我們從PDB文件（1U9V）中刪除原先的抑制分子IHE，利用Chimera軟件將新設(shè)計(jì)的化合物底物插入到原先IHE分子的位置，堵住組織蛋白酶K的催化位點(diǎn)（由CYS 25和HIS 162組成）（圖7）。基于QM/MM的理論，利用Multilayer Onion Model計(jì)算方法我們將CYS 25中的硫原子設(shè)為中心點(diǎn)，與之長(zhǎng)度為8 Angstroms的空間內(nèi)包含的所有原子設(shè)定為QM區(qū)域，共有底物、HIS 162、CYS 25、ALA 163、GLY 64和GLY 65包含在QM區(qū)域內(nèi)。其余都設(shè)定為MM區(qū)域（包含3160個(gè)原子）。用程序UB3LYP（6-31G）優(yōu)化QM區(qū)域。用程序UFF優(yōu)化MM區(qū)域。再利用CHARMM軟件向最新優(yōu)化后的PDB文件中加入水分子，將整個(gè)體系包含在直徑為60 Angstroms的水球內(nèi)，如圖8所示。

最后，我們將加入水分子后的大系統(tǒng)通過(guò)之前同樣的Multilayer Onion Model計(jì)算方法將系統(tǒng)結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到最終的能量最低的產(chǎn)物狀態(tài)（C），隨后我們依照?qǐng)D3的反應(yīng)式往回通過(guò)掃描式計(jì)算的方法得到中間態(tài)的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。首先，我們切斷帶有腈基集團(tuán)底物上的N-H鍵，并同時(shí)縮小H 3248和與之相鄰的組氨酸集團(tuán)（HIS 162）的N 2361之間的距離，通過(guò)輸入指令：

3248 2361 S 10 -0.05

表明我們?nèi)藶橥ㄟ^(guò)10個(gè)反應(yīng)步驟（步步使用Multilayer Onion Model計(jì)算方法進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化）縮小H 3248和N 2361的距離，每一步的縮小距離是0.05 angstroms。我們得到掃描式計(jì)算中能量最高點(diǎn)的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)（TSB）和能量最低點(diǎn)的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)（B）。所有原子的數(shù)值標(biāo)記都根據(jù)原始GJF文件。

我們隨之將系統(tǒng)結(jié)構(gòu)B依照?qǐng)D三的反應(yīng)式繼續(xù)往回通過(guò)同樣的掃描計(jì)算式方法，首先切斷中間底物（腈基化合物）的C-S鍵，并同時(shí)增大S 367與之相鄰的半胱氨酸基團(tuán)（CYS 25）的C 3249之間的距離，通過(guò)輸入指令：

3249 367 S 10 0.1

表明我們?nèi)藶橥ㄟ^(guò)10個(gè)反應(yīng)步驟（步步使用Multilayer Onion Model計(jì)算方法進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化）增加S 367和C 3249的距離，每一步的增加距離是0.1 angstroms。

最終，我們從結(jié)合物C逆計(jì)算得到產(chǎn)物A、TSA、B、TSB的結(jié)構(gòu)如圖9所示。

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