體外擴(kuò)增自體脂肪干細(xì)胞對空鼻綜合征患者黏膜功能重建的臨床研究

李梁，賈德進(jìn)，閆俊靈，陳沖，丁紅，湯蘇陽

空鼻綜合征(empty nose syndrome，ENS)是一種由鼻-鼻腔手術(shù)切除引起的醫(yī)源性鼻生理功能慢性衰退性疾病。文獻(xiàn)顯示，下鼻甲切除后約有20%的患者會(huì)發(fā)展為ENS[1-2]。ENS主觀感覺的嚴(yán)重程度與客觀檢查不平行，很容易引發(fā)醫(yī)患矛盾；令人痛惜的“溫嶺殺醫(yī)血案”、“北大襲醫(yī)案”都是由此病而引發(fā)的。建立ENS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，阻斷ENS的發(fā)生發(fā)展，緩解ENS的臨床癥狀是當(dāng)前亟須解決的問題。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年8月－2014年2月在武警總醫(yī)院皮膚再生醫(yī)學(xué)科、耳鼻喉科就診的ENS患者，經(jīng)SCL-90自評癥狀量表心理測試(250分以下)、焦慮自評量表測試(中度以下)及抑郁自評量表測試(中度以下)，篩選出5例患者，其中男4例，女1例，年齡22～30歲，平均26歲，健康狀況良好，無其他系統(tǒng)性疾病，均為雙側(cè)鼻腔手術(shù)后繼發(fā)ENS。其中3例ENS患者有鼻甲殘留，2例無鼻甲殘留。主觀癥狀：鼻黏膜干燥，通氣過度，吸氣干冷，睡眠質(zhì)量差。治療前均行鼻內(nèi)鏡檢查、鼻腔鼻竇結(jié)局測試20條(sino-nasal outcome test -20，SNOT-20)問卷調(diào)查[1-2]、鼻聲阻力和鼻黏膜纖毛清除功能測定。所有患者均簽訂知情同意書，并經(jīng)武警總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 自體脂肪干細(xì)胞(adipose tissue-derived stromal cells，ASCs)制備 入選患者行血液常規(guī)檢查及傳染病抗原抗體檢測(包括各項(xiàng)肝炎、梅毒、艾滋病抗體)。從患者下腹部和大腿通過吸脂手術(shù)抽取脂肪15～20ml，經(jīng)終濃度0.1%Ⅰ型膠原蛋白酶、胰酶消化、離心，去除脂肪及上清液，重懸沉淀，經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾，再次離心，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞、磷酸鹽緩沖液洗滌2次，所得細(xì)胞提取物用含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸，以適當(dāng)密度接種于無菌培養(yǎng)瓶中，4～5d后加液，之后每3d換液1次，待原代細(xì)胞達(dá)85%融合，用0.05%胰蛋白酶消化，按照1:2比例傳代。傳至第3代(P3)時(shí)按《中華人民共和國藥典》2010年版三部附錄ⅫA無菌檢測法進(jìn)行檢測，采用全自動(dòng)微生物培養(yǎng)檢測系統(tǒng)檢測支原體、人源特定病毒、豬源病毒、內(nèi)毒素，結(jié)果均呈陰性；細(xì)胞形態(tài)及活性觀察、染色體核型分析、ASCs免疫表型鑒定結(jié)果均顯示無異常。

1.2.2 ASCs聯(lián)合脂肪顆粒移植鼻甲成形術(shù) 對有鼻甲殘留的3例ENS患者，在鼻甲黏膜受損處進(jìn)行ASCs注射移植，隔10日1次，共4次；對無鼻甲殘留的2例ENS患者，在鼻黏膜受損處進(jìn)行ASCs注射移植，隔10日1次，3次后，抽取其自體單純脂肪顆粒1～5ml，與1×107～5×107個(gè)第3～6代ASCs混合后，行鼻內(nèi)鏡下鼻甲或中鼻甲成形術(shù)。治療后3、6、9個(gè)月分別行鼻內(nèi)鏡檢查、SNOT-20問卷調(diào)查、鼻聲阻力鼻黏膜纖毛清除功能測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床表現(xiàn) 5例ENS患者ASCs聯(lián)合脂肪顆粒移植鼻甲成形術(shù)后未出現(xiàn)感染、過敏等癥狀。4例患者主觀癥狀明顯改善，自感鼻黏膜濕潤，通氣時(shí)黏膜的緊繃感消失，吸氣時(shí)鼻腔疼痛癥狀消失，睡眠質(zhì)量明顯改善。1例患者鼻黏膜干燥癥狀明顯改善，但通氣過度癥狀仍存在。

2.2 鼻內(nèi)鏡檢查 鼻內(nèi)鏡下可見治療后3個(gè)月鼻黏膜較治療前顏色紅潤，黏液分泌增多，硬痂減少(圖1)。

2.3 SNOT-20評價(jià) 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，治療前5例患者SNOT-20問卷總分與治療后3、6、9個(gè)月比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，干燥、鼻空、入睡困難項(xiàng)得分治療前與治療后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，患者這3個(gè)癥狀有明顯改善。其他因素治療前的癥狀不明顯，得分低，治療后與治療前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

2.4 鼻聲阻力與黏膜纖毛清除功能測定結(jié)果 與治療前相比，5例患者鼻甲成形術(shù)后鼻阻力有所增加，鼻腔容積及鼻腔最小橫斷面積有所減少，鼻黏膜纖毛清除功能有所改善，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表2)。

3 討 論

ENS常發(fā)生于鼻-鼻腔手術(shù)后數(shù)月到數(shù)年，其診斷主要依靠患者的癥狀、體征以及既往手術(shù)史。國外學(xué)者認(rèn)為鼻黏膜面積減少[3]、鼻阻力改變共同參與了ENS的發(fā)生。鼻黏膜分布有腺體、感受器等，具有加溫、加濕、免疫、清潔等作用，鼻部特有的解剖結(jié)構(gòu)形成鼻阻力，可調(diào)節(jié)鼻腔氣流及層流狀態(tài)，ENS患者上述功能衰退，影響了其正常的工作與生活。

目前在鼻-鼻腔手術(shù)中盡可能保護(hù)鼻黏膜、預(yù)防ENS的發(fā)生已經(jīng)成為耳鼻喉科醫(yī)生的共識。臨床上常采用羥基磷灰石、自體軟骨[4]、多孔聚乙烯、Gore-Tex、脫細(xì)胞真皮等植入ENS患者鼻黏膜下，用以改善鼻阻力及鼻腔通氣狀況，具有一定的治療效果，但上述方法對ENS黏膜功能恢復(fù)的作用尚不明確。

圖1 鼻甲成形術(shù)前后鼻黏膜情況比較Fig. 1 Nasal turbinate after angioplasty compared to the situation

表1 治療前和治療后3、6、9個(gè)月SNOT-20問卷得分比較(，n=5)Tab.1 Before treatment and after 3, 6, 9 months SNOT-20 questionnaire scores compare s, n=5)

表1 治療前和治療后3、6、9個(gè)月SNOT-20問卷得分比較(，n=5)Tab.1 Before treatment and after 3, 6, 9 months SNOT-20 questionnaire scores compare s, n=5)

(1)P＜0.05 compared with before treatment

Item Before treatment After treatment (month)3 6 9 Need to blow nose 1.9±1.7 1.1±1.3 1.3±0.9 1.2±0.2 Sneezing 1.0±1.1 0.8±1.2 0.5±0.6 0.3±0.2 Runny nose 0.6±1.1 0.5±0.7 0.5±0.5 0.5±0.3 Cough 1.4±1.7 1.2±1.6 0.8±1.3 0.5±0.2 Postnasal discharge 2.5±1.9 1.3±2.1 1.0±1.6 0.4±0.3 Thick nasal discharge 0.8±1.3 0.5±0.2 0.6±0.9 0.3±0.3 Ear fullness 0 0 0 0 Dizziness 1.5±1.2 0.8±0.7 0.9±0.5 0.3±0.3 Ear pain 0 0 0 0 Facial pain/pressure 1.5±0.9 0.5±0.6 0.6±0.5 0.5±0.4 Difficulty falling asleep 4.3±2.3 2.2±2.4(1) 2.0±1.8(1) 0.7±0.3(1)Waking up at night 4.0±2.1 2.0±1.8 1.9±1.2 1.0±0.3 Lack of good night's sleep 3.5±2.1 1.3±2.0 1.4±1.3 0.7±0.4 Waking up tired 3.3±1.9 1.5±1.9 1.2±1.6 1.1±0.3 Fatigue 3.6±1.7 1.5±1.9 1.3±1.2 1.3±0.3 Reduced productivity 3.7±1.9 1.5±2.1 1.4±1.3 1.3±0.4 Reduced concentration 3.9±1.5 1.8±2.0 1.3±1.3 1.4±0.3 Frustration/restlessness/irritability 2.8±1.5 1.1±1.8 1.2±1.0 0.8±0.5 Sadness 3.0±1.6 1.2±1.5 1.1±1.3 1.0±0.4 Embarrassment 2.9±1.8 1.4±2.1 1.4±1.6 1.4±0.5 Dryness 4.5±1.3 2.5±1.2(1) 0.5±0.6(1) 0.5±0.1(1)Difficulty with nasal breathing 2.1±1.5 1.0±0.9 0.6±0.7 0.4±0.2 Suffocation 1.5±1.5 0.2±0.3 0.3±0.6 0.3±0.2 Nose is too open 4.0±2.0 2.0±0.9(1) 1.5±1.2(1) 0.6±0.3(1)Nasal crusting 3.1±1.8 1.5±0.4 1.2±0.5 0.5±0.2 Total score 50.1±18.7 22.6±15.8(1) 20.4±18.9(1) 17±6.9(1)

表2 鼻聲阻力、鼻黏膜纖毛清除功能治療前、后比較±s，n=5)Tab.2 Nasal sound resistance, nasal mucociliary clearance function before and after treatment ±s, n=5)

表2 鼻聲阻力、鼻黏膜纖毛清除功能治療前、后比較±s，n=5)Tab.2 Nasal sound resistance, nasal mucociliary clearance function before and after treatment ±s, n=5)

Item Before treatment After treatment (month)3 6 9 NAR (cmH2O/L/Mi) 1.02±0.60 1.23±0.25 1.19±0.45 1.32±0.63 NV (cc) 20.03±3.85 15.25±1.45 16.84±2.307 16.34±1.82 MCA (cm2) 0.71±0.10 0.55±0.65 0.59±0.45 0.50±0.13 MCC (s) 1526.23±1000.43 1457.13±1078.23 1232.03±499.45 1501.00±1159.85

本研究采用ASCs聯(lián)合脂肪顆粒移植進(jìn)行鼻內(nèi)微創(chuàng)鼻甲成形術(shù)治療ENS，取得了較好的效果。ASCs具有來源廣泛、取材容易、損傷小、增殖迅速、表型穩(wěn)定、低免疫原性、遺傳穩(wěn)定等特點(diǎn)，并有向中胚層的脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞等分化的潛能。體外擴(kuò)增的ASCs能提高移植脂肪細(xì)胞的成活率，促進(jìn)移植脂肪的血管再生，降低脂肪顆粒吸收、液化及感染的發(fā)生率，一次移植成形效果較好[4-6]。本組5例患者黏膜重建手術(shù)后鼻腔干燥、矛盾性鼻阻[7]癥狀明顯改善。矛盾性鼻阻是指患者主觀感覺鼻塞，但與鼻腔檢查發(fā)現(xiàn)鼻腔容積足夠或過于寬大的結(jié)果不相符[8]。此外，本組患者治療后鼻黏膜對冷空氣的加溫、加濕作用明顯改善，吸氣時(shí)鼻腔及面部疼痛癥狀消失，睡眠質(zhì)量明顯改善。該結(jié)果表明ASCs聯(lián)合脂肪顆粒移植進(jìn)行鼻內(nèi)微創(chuàng)鼻甲成形，重建了ENS患者的鼻黏膜，恢復(fù)了鼻甲黏膜面積和鼻腔正常生理功能。本研究采用體外培養(yǎng)擴(kuò)增的第3～6代ASCs，具有免疫表型及遺傳性狀穩(wěn)定，分化潛能好的優(yōu)點(diǎn)。移植時(shí)將1×107個(gè)ASCs與1ml脂肪顆?；旌?，ASCs以脂肪顆粒細(xì)胞為支架行增殖分化，而ASCs分泌的細(xì)胞因子、基質(zhì)能提高移植后脂肪細(xì)胞的成活率，二者發(fā)揮協(xié)同作用，從而起到促進(jìn)鼻甲成形、增加鼻黏膜面積的作用。

本研究在5例ENS患者中進(jìn)行了ASCs聯(lián)合脂肪顆粒移植鼻甲成形術(shù)，結(jié)果顯示該方法效果較好，但由于隨訪時(shí)間短、樣本量小等不足，還需要更深入的研究來充分證實(shí)其臨床療效及作用機(jī)制。

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