新疆維吾爾族群體30個常染色體InDel位點的遺傳多態(tài)性研究

百茹峰，賈振軍，姜立喆，呂小嬌，袁麗，石美森

插入/缺失多態(tài)性(insertion/deletion polymorphisms，InDel)是指基因組中插入或缺失不同大小的DNA片段所形成的多態(tài)性遺傳標記[1]。2002年，Weber等[2]最早報道了2000個二等位基因InDel標記的遺傳特征、定位以及在四大種群中的等位基因頻率。在此基礎上，Mills等[3]2006年在Genome Research雜志上發(fā)表了一個包含了人類基因組中415 000余個InDel標記的圖譜，這一工作大大地促進了InDel在各領域的應用研究[4-7]。從法醫(yī)學應用角度來看，InDel遺傳標記具備更低的突變率(代間突變率STR 10-3；SNP 2.3×10-8；InDel 2.3×10-9[8-9])、擴增片段長度可以極大縮短應用于DNA高度降解檢材，由于其兼具了STR和SNP兩種遺傳標記的雙重優(yōu)點且能夠與普遍使用的STR分型技術平臺相兼容，受到了國內外法醫(yī)學者的關注[10-13]。目前成熟的InDel商品化試劑盒為Investigator? DIP，本研究擬對該體系中的30個InDel位點在新疆維吾爾族人群中的等位基因頻率和遺傳多態(tài)性進行分析，以建立新疆維吾爾族群體30個InDel位點的群體遺傳學資料，為法醫(yī)學個體識別和親權鑒定、疾病相關基因分析及人類學等相關領域研究提供參考數(shù)據。

1 材料與方法

1.1 實驗樣本及儀器 本研究在當?shù)匦l(wèi)生行政部門的支持配合下采取知情同意的原則, 隨機選取采集223名新疆維吾爾族無關男性個體外周血樣，置于FTA采血卡上，－20℃保存。Investigator? DIP試劑盒(Qiagen公司，德國)；9700型擴增儀(PE公司，美國)；3130 XL型遺傳分析儀(Life Technologies公司，美國)；微量移液器、高速離心機(Eppendorf公司，德國)。

1.2 實驗方法 采用5% Chelex-100快速提取法提取樣本DNA。采用5μl復合擴增體系，含反應混合物A1.0μl，引物1.0μl，多重Taq2 DNA聚合酶0.2μl，模板DNA 0.5～1.0ng，補滅菌去離子水至5μl。PCR擴增條件為：94℃預變性4min；94℃變性30s，61℃復性120s，72℃延伸75s，30個循環(huán)；最后68℃延伸60min，10℃保溫。PCR 產物變性后在3130 XL型遺傳分析儀上進行毛細管電泳，用GeneMapper ID v3.2軟件對30個InDel位點和性別基因座Amelogenin進行分型，每批樣本檢測均采用XX28和超純水分別作為陽性對照和陰性對照。

1.3 統(tǒng)計學處理 運用 Power Stats v12.xls軟件(http://www.promega.com/geneticidtools/powerstats)統(tǒng)計分析30個InDel位點的等位基因頻率、個體識別率(probability of discrimination power，DP)、多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)和非父排除率(probability of exclusion，PE)等法醫(yī)學相關參數(shù)；采用Cervus 3.0(http://www.field genetics.com/pages/home.jsp)軟件計算三聯(lián)體非父排除率(PEtrio)和二聯(lián)體非父排除率(PEduo)。采用Arlequin 3.5軟件(http://cmpg.unibe.ch/software /arlequin3.5)計算30個InDel位點的觀察值雜合度(heterozygosity of observation，Ho)和期望值雜合度(heterozygosity ofexpect，He)，并進行各位點Hardy-Weinberg平衡、位點間連鎖不平衡檢驗。采用Wrigh公式[14]計算各群體間遺傳分化系數(shù)Fst。采用XLSTAT(version 2009.4.07；Addinsoft SARL, http://www.xlstat.com/en/company/)進行多維尺度(multi-dimensional scaling，MDS)分析。

2 結 果

2.1 30個InDel位點的等位基因分型結果 在223份新疆維吾爾族無關男性個體血樣中，Investigator?DIP試劑盒中的30個InDel位點都得到了有效擴增，無Stutter峰，擴增片段長度均在76～158bp之間，純合子只顯現(xiàn)1個等位基因峰，雜合子則有2個等位基因峰且峰高比例＞70%(圖1)。

圖1 Investigator? DIP中的30個InDel位點在1例新疆維吾爾族男性個體的基因分型結果Fig.1 The genotype of 30 InDel loci in one Xinjiang Uygur ethnic male amplified using Investigator? DIPplex Kit

表1 新疆維吾爾族群體30 個InDel位點的群體遺傳學參數(shù)Tab.1 The population genetic parameters of 30 InDel loci in Chinese Uygur ethnic group living in Xinjiang

2.2 新疆維吾爾族族群體30個Indel位點的群體遺傳學參數(shù) 統(tǒng)計分析結果見表1，各位點觀察值雜合度(Ho)為0.3857～0.5381，平均觀察值雜合度為0.4686；期望值雜合度(He)為0.3770～0.5011，平均期望值雜合度為0.4738。采用Bonferroni法校正，將P值設為0.0017(0.05/30)，30個InDel位點的基因型頻率分布在新疆維吾爾族群體中均達到Hardy-Weinberg平衡(P＞0.0017)。30個InDel位點的缺失等位基因頻率在0.2510～0.6860之間，除HLD64、HLD81位點外，其余28個位點的缺失等位基因頻率在0.3000～0.7000之間，顯示30個InDel位點在新疆維吾爾族群體的等位基因頻率分布相對較均衡；個體識別率(DP)為0.5430～0.6470，平均為0.6095；多態(tài)信息含量(PIC)為0.31～0.37，平均為0.36；三聯(lián)體非父排除率(PEtrio)為0.1050～0.2190；二聯(lián)體非父排除率(PEduo)為0.0707～0.1250。

2.3 新疆維吾爾族群體30個InDel位點的連鎖不平衡檢驗 30個InDel位點兩兩之間共進行435次連鎖不平衡檢驗，其中有23次比較結果的P值低于檢驗水準0.05，界于0.004 28～0.048 67之間，且該23對兩兩比較的位點均位于不同的染色體上，經過Bonferroni法校正，將P值設為0.000 115(0.05/435)后各位點間均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象(P＞0.000 115)。

2.4 新疆維吾爾族群體與其他群體的遺傳分化系數(shù)Fst及多維尺度分析(MDS) 從已報道的文獻中找到與本研究相同的30個InDel位點的群體：北京漢族[14]、廣東漢族[15]、漢族[16]、維吾爾族[16]、哈薩克族[16]、藏族[16]、朝鮮[17]、葡萄牙[18]、丹麥[19]、捷克[20]、德國[20]、西班牙[21]、巴斯克[21]、高加索裔美國人[22]、拉美裔美國人[22]、非裔美國人[22]及亞裔美國人[22]，計算的遺傳分化系數(shù)Fst值見表2，遺傳距離見表3，多維尺度分析結果見圖2。

表2 30個InDel 遺傳標記在18個群體中的Fst值Tab.2 Fst based on the comparison of allele frequencies F(del) in 18 population studies using 30 Indels in the DIPplex? kit

3 討 論

維吾爾族是古代北亞民族的回鶻和中亞中世紀各穆斯林的后裔，世界維吾爾族人口1250萬，其中大部分都在中國新疆維吾爾自治區(qū)居住，2011年中國第六次人口普查顯示，中國境內的維吾爾族人口為10 069 347人，占中國人口的0.7555%，是中國第4大少數(shù)民族。本研究選擇Investigator? DIPplex試劑盒中的30個InDel位點對新疆維吾爾族群體進行遺傳多態(tài)性調查，同時探討其與其他群體之間的遺傳學關系，有助于分析InDel遺傳標記在不同民族或同一民族不同群體間的遺傳、進化的相互關系，為科學應用InDel遺傳標記提供理論基礎。

本研究結果顯示，經過Bonferroni法校正，30個InDel位點的基因型頻率分布在新疆維吾爾族群體中達到Hardy-Weinberg遺傳平衡，因此本研究樣本是可靠的。連鎖不平衡檢驗結果表明，30個InDel位點在西藏藏族群體中不存在連鎖不平衡現(xiàn)象(P＞0.000 115)，提示這些位點是相互獨立的遺傳標記，可以應用于法醫(yī)學鑒定。對InDel遺傳標記的多態(tài)性及其法醫(yī)學應用價值一般可用PIC、Ho、He、PD和PE等指標來衡量，本研究各位點等位基因頻率F(del)為0.2510～0.6860，觀察值雜合度(Ho)為0.3857～0.5381，平均觀察值雜合度為0.4686；期望值雜合度(He)為0.3770～0.5011，平均期望值雜合度為0.4738；多態(tài)信息含量(PIC)為0.31～0.37；個體識別率(DP)為0.5430～0.6470，累積個體識別率(TDP)為0.999 999 999 999 5；30個InDel位點的累積非父排除率(CPEtrio)為0.995 478，二聯(lián)體累積非父排除率(CPEduo)為0.972 007，綜合各文獻群體[15-23]的相應數(shù)據亦均不能達到0.9999，因此Investigator?DIP試劑盒目前只能作為法醫(yī)常規(guī)STR分型試劑盒的有效補充。由表1觀察發(fā)現(xiàn)維吾爾族群體中F(del)、Ho、DP、PIC、PEduo、PEtrio的最小值均在HLD64位點出現(xiàn)，此外，HLD111、HLD118、HLD99及HLD39等位點在本研究及已報道的研究群體[15-17]中的雜合度及PIC也較低，提示這些位點可能在亞洲人群中的遺傳多態(tài)性較低。

表3 新疆維吾爾族群體與其他17個群體的遺傳距離Tab.3 Comparison of the genetic distance among 18 different races and ethnic groups

圖2 新疆維吾爾族與其他17個群體的30個InDel等位基因頻率MDS分析結果Fig.2 MDS plot based on the pairwise correlations of Indels allele frequencies across 18 populations

Fst又稱為近交系數(shù)，是進行群體間遺傳分化概括分析最常用的方法之一。Fst指示特定基因座位在群體間的分化程度。Wright等[14]認為群體間Fst值在0～0.05表示群體間不存在分化；Fst值在0.05～0.15則為中度分化；Fst值在0.15～0.25則為高度分化，大于0.25則分化度極大。本研究中，HLD111和HLD118等位點Fst值均大于0.15，在18個群體中遺傳分化貢獻率相對較高。提示這兩個位點在不同民族尤其是不同人種中基因型分布有很大差異，反映群體差異性大，在群體遺傳學和種群識別方面有重要的應用價值。

遺傳距離亦是表示群體間遺傳差異或遺傳分化的重要參數(shù)，是以兩個群體間同一座位上相同等位基因的頻率差異的函數(shù)來測定的。本研究中的新疆維吾爾族和國內漢族、其他民族及歐美等群體的遺傳距離差異由小到大依次為:維吾爾族2(0.240)→哈薩克族(0.312)→藏族(0.575)→歐美白種人(0.507～0.686)→漢族及亞洲裔群體(0.577～0.734)→非裔美國人(1.089)，維吾爾族群體與漢族群體間的遺傳距離大于其與歐美白種人群。從MDS的散點圖結果亦可以看出，18個比較人群大致可以劃分成4個類群，分別是：第一類群，非裔美國人(尼格羅人種)；第二類群，丹麥、捷克、高加索裔美國人、德國、拉美裔美國人、西班牙、巴斯克、葡萄牙構成的白種人組群；第三類群，兩個維吾爾族及哈薩克族；第四類群，藏族、漢族、北京漢族、廣東漢族、亞裔美國人及朝鮮人構成的蒙古人種族群。結合本研究結果，并參考有關歷史文獻、當?shù)氐牡乩?、民俗和文化人類學研究的成果[24-25]，我們認為，維吾爾族有較大比例的高加索人種的混雜程度，有別于屬于蒙古人種的漢族和藏族。另外，維吾爾族和哈薩克族有著共同的宗教信仰，而且在兩個民族的形成和發(fā)展中很可能有著相同或相近的淵源，因此遺傳距離相近。這些結果基本符合從歷史、考古、語言、地理和體質人類學等方面進行的劃分，充分表明以InDel遺傳標記的等位基因頻率為基礎計算的遺傳距離及MDS分析，能夠適用于群體遺傳學和民族、種族研究。

綜上，本研究首次獲得了新疆維吾爾族群體HLD77等30個InDel位點的等位基因頻率及基因型分布數(shù)據，為建立新疆地區(qū)維吾爾族群體InDel分布數(shù)據庫、群體遺傳關系的分析及法醫(yī)學應用提供了良好的遺傳背景數(shù)據。

[1]Liu XD, Fan QL, Yao L, et al. Association of ACE gene I/D polymorphism and diabetic nephropathy in Chinese Han population: a Meta-analysis[J]. J Logist Univ CAPF (Med Sci),2012, 21(6): 412-416, 420. [劉曉丹, 范秋靈, 姚麗, 等. 中國漢族人群糖尿病腎病ACE基因I/D多態(tài)性的Meta-分析[J]. 武警后勤學院學報(醫(yī)學版), 2012, 21(6): 412-416, 420.]

[2]Weber JL, David D, Heil J, et al. Human diallelic insertion/deletion polymorphisms[J]. Am J Hum Genet, 2002, 71(4):854-862.

[3]Mills RE, Luttig CT, Larkins CE, et al. An initial map of insertion and deletion (INDEL) variation in the human genome[J].Genome Res, 2006, 16(9): 1182-1190.

[4]Bhangale TR, Rieder MJ, Livingston RJ, et al. Comprehensive identification and characterization of diallelic insertion-deletion polymorphisms in 330 human candidate genes[J]. Hum Mol Genet, 2005, 14(91): 59-69.

[5]Bastos-Rodrigues L, Pimenta JR, Pena SD. The genetic structure of human populations studied through short insertion-deletion polymorphisms[J]. Ann Hum Genet, 2006, 70(Pt 5): 658-665.

[6]Mills RE, Pittard WS, Mullaney JM, et al. Natural genetic variation caused by small insertions and deletions in the human genome[J]. Genome Res, 2011, 21(6): 830-839.

[7]Pereira R, Phillips C, Alves C, et al. A new multiplex for human identification using insertion/deletion polymorphisms[J].Electrophoresis, 2009, 30(21): 3682-3690.

[8]Levy S, Sutton G, Ng PC, et al. The diploid genome sequence of an individual human[J]. PLoS Biol, 2007, 5(10): e254.

[9]Nachman MW, Crowell SL. Estimate of the mutation rate per nucleotide in humans[J]. Genetics, 2000, 156(1): 297-304.

[10]Manta F, Caiafa A, Pereira R, et al. Indel markers: Genetic diversity of 38 polymorphisms in Brazilian populations and application in a paternity investigation with post mortem material[J]. Forensic Sci Int Genet, 2012, 6(5): 658-661.

[11]Santos NP, Ribeiro-Rodrigues EM, Ribeiro-Dos-Santos AK, et al. Assessing individual interethnic admixture and population substructure using a 48-insertion-deletion (INSEL) ancestryinformative marker (AIM) panel[J]. Hum Mutat, 2010, 31(2):184-190.

[12]Zhao SM, Zhang SH, Li CT. InDel_Typer30: A multiplex PCR system for DNA identification among five Chinese populations[J]. J Forensic Med, 2010, 26(5): 343-348, 356. [趙書民, 張素華, 李成濤. InDel-typer30: 用于中國5個主要民族DNA鑒定的多重PCR系統(tǒng)[J]. 法醫(yī)學雜志, 2010, 26(5): 343-348, 356.]

[13]Li CT, Zhang SH, Zhao SM. Genetic analysis of 30 InDel markers for forensic use in five different Chinese populations[J].Genet Mol Res, 2011, 10(2): 964-979.

[14]Wright S. Evolution and the genetics of populations. In:Variability within and among natural populations[C]. Chicago:University of Chicago Press, 1978.

[15]Bai RF, Jiang LZ, Zhang Z, et al. Genetic polymorphism and forensic application of 30 InDel loci of Han population in Beijing[J]. Hereditas (Beijing), 2013, 35(12): 1368-1376. [百茹峰, 姜立喆, 張中, 等. 北京漢族群體30個常染色體InDel位點群體遺傳學及法醫(yī)學研究[J]. 遺傳, 2013, 35(12): 1368-1376.]

[16]Hong L, Wang XG, Liu SJ, et al. Genetic polymorphisms of 30 Indel loci in Guangdong Han population[J]. J Sun Yat-sen Univ(Med Sci), 2013, 34(2): 299-304. [洪麗, 王小廣, 劉素娟, 等.30個插入/缺失多態(tài)性位點在中國廣東漢族人群中的遺傳多態(tài)性[J]. 中山大學學報(醫(yī)學科學版), 2013, 34(2): 299-304.]

[17]Wei YL, Qin CJ, Dong H, et al. A validation study of a multiplex INDEL assay for forensic use in four Chinese populations[J].Forensic Sci Int, Genetics, 2014, 9: e22-e25.

[18]KimEH, Lee HY, Yang IS, et al. Population data for 30 insertiondeletion markers in a Korean population[J]. Int J Legal Med,2014, 128(1): 51-52.

[19]Carvalho A, Pinheiro MF. Population data of 30 insertion/deletion polymorphisms from a sample taken in the North of Portugal[J]. Int J Legal Med, 2013, 127(1): 65-67.

[20]Friis SL, B?rsting C, Rockenbauer E, et al. Typing of 30 insertion/deletions in Danes using the first commercial Indel kit-Mentype? DIPplex[J]. Forensic Sci Int Genet, 2012, 6(2):e72-e74.

[21]Zidkova A, Horinek A, Kebrdlova V, et al. Application of the new insertion–deletion polymorphism kit for forensic identification and parentage testing on the Czech population[J]. Int J Legal Med, 2013, 127(1): 7-10.

[22]Martín P, García O, Heinrichs B, et al. Population genetic data of 30 autosomal Indels in Central Spain and the Basque Country populations[J]. Forensic Sci Int Genet, 2013, 7(2): e27-e30.

[23]LaRue BL, Ge JY, King JL, et al. A validation study of the Qiagen Investigator DIPplex? kit; an INDEL-based assay for human identification[J]. Int J Legal Med, 2012, 126(4): 533-540.

[24]Calafell F, ComasD, Pérez-Lezaun A, et al. Genetics and population history of Central Asia. In Archaeogenetics: DNA and the population prehistory of Europe[M]. Cambridge:McDonald Institute for Archaeological Research, 2000. 259-266.

[25]Xu MY, Hong KX, Ma J, et al. Analysis of HLA-B locus gene polymorphism in Sichuan Yi ethnic group and Xinjiang Uygur ethnic group[J]. Hereditas (Beijing), 2006, 28(8): 913-917. [許銘炎, 洪坤學, 馬軍, 等. 四川彝族和新疆維吾爾族HLA-B基因座基因多態(tài)性分析[J]. 遺傳, 2006, 28(5): 913-917.]