PCNA對口腔鱗癌細胞凋亡和增殖的影響

趙莉琳，劉陽

口腔癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，全球每年新增口腔癌患者約10萬人[1]。絕大多數(shù)口腔癌為口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)，惡性程度較高，治療主要以手術、放化療相結合的綜合治療為主，患者的5年生存率僅為50%[2]。近年來，靶向藥物設計從多個信號途徑對腫瘤進行抑制，已成為研究的熱點，因此，對口腔鱗癌進行深入研究，尋找更多的潛在靶點十分必要[3-4]。增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)只存在于正常增殖細胞以及腫瘤細胞內，與細胞DNA合成密切相關，對細胞增殖起重要作用[5-6]，是細胞異常增殖的關鍵蛋白。近年來，PCNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系逐漸成為研究熱點[7]。PCNA基因在很多腫瘤中高表達，包括胃癌、肝癌、結腸癌、乳腺癌、膀胱癌以及肺癌等[8-10]。李向新等[11]對48例口腔鱗癌組織以及正?？谇火つぶ蠵CNA蛋白的表達水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，PCNA在48例口腔鱗癌中均有不同程度表達，而在正?？谇火つぜ毎芯鶠楸磉_陰性，提示PCNA可能在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。阿達萊提等[12]也報道了同樣的發(fā)現(xiàn)。本研究通過增強或者抑制PCNA在口腔鱗癌TCA8113細胞中的表達，探討了PCNA基因在TCA8113細胞系凋亡和增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人口腔鱗癌細胞株TCA8113、低表達載體pSilencer、高表達載體pcDNA3.1由本室保存，RPMI 1640，胎牛血清、Trizol、Lipofectamine 2000、反轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司。Myc抗體購自北京全式金生物技術有限公司，兔抗鼠二抗購自北京中杉金橋公司。限制性內切酶、Taq酶等常用試劑購自日本TaKaRa公司或全式金生物技術有限公司。引物合成、測序在上海生工生物工程公司進行。四甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國Sigma公司，順鉑購于山東齊魯制藥廠，使用濃度為4μg/ml。實時熒光定量PCR試劑盒為全式金生物技術有限公司產品，凋亡檢測試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人口腔鱗癌TCA8113細胞株在37℃、5%CO2條件下，用含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 質粒構建 質粒構建按常規(guī)操作。設計合成特異性PCNA引物，從cDNA模板中PCR克隆出PCNA基因CDS全長，經過酶切、連接，構建成功pcDNA3.1-PCNA高表達載體，重組載體融合Myc標簽，可用Anti-Myc抗體檢測。RNA干涉采用文獻設計的小發(fā)夾RNA序列[13]，shPCNA靶序列為：正義5'-CAGACAAGTAATGTCGATAAA-3'，反義5'-TTTATCGACATTACTTGTCTG-3'。按要求合成序列，克隆入pSilencer載體，構建pSilencer-shPCNA干涉載體。所有實驗用載體均經過測序驗證。

1.4 Western blotting檢測PCNA高表達 將構建的pcDNA3.1-PCNA重組載體轉染TCA8113細胞，轉染48h后收集細胞行Western blotting檢測。按照要求制備樣品，加入電泳緩沖液，配制聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，上樣電泳，轉膜。取出PVDF膜后進行抗體孵育，采用化學發(fā)光底物檢測。以pcDNA3.1空載體轉染作為對照組。

1.5 實時熒光定量PCR 制備cDNA模板，按照試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR檢測。PCNA：正義5'-AAGCCGAAACCAGCTAGACTTTC-3'，反義5'-TGGCGGAGTGGCAACAA-3'；Actin：正義5'-AGGCCAACCGTGAAAAGATG-3'，反義5'-ACCAGAGGCATACAGGGACAA-3'。將熒光染料SYBR Green與目的基因PCNA和內參Actin的引物混勻，放入實時PCR儀進行反應，測定PCNA mRNA表達的Ct值，計算mRNA的相對表達量[14]。

1.6 細胞凋亡檢測 將pcDNA3.1-PCNA(高表達)或pSilencer-shPCNA(沉默)轉染TCA8113細胞，48h后收集細胞，采用Annexin V/PI染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡。按照說明書進行操作，首先收集細胞并洗滌制備樣品，將細胞與Annexin V試劑孵育，冰上反應30min，臨檢測前加入5μl碘化丙啶(propidium iodide，PI)，立即上流式細胞儀檢測。以pcDNA3.1空載體轉染作為對照組，pcDNA3.1-PCNA或pSilencer-shPCNA轉染為實驗組，重復3次。同樣另設對照組和實驗組細胞，轉染后加入4μg/ml順鉑處理，即可檢測PCNA對順鉑誘導細胞凋亡的影響。

1.7 細胞增殖檢測 將TCA8113細胞接種于96孔板，轉染pcDNA3.1-PCNA重組載體或pcDNA3.1空載體(各設4孔)，分別于轉染24、48、72、96h后，每孔加入10μl MTT儲液(10mg/ml)，37℃培養(yǎng)4h，小心吸出孔內培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，酶標儀檢測A490值。實驗組存活率=(實驗組A490/對照組A490)×100%。實驗重復3次。pSilencer-shPCNA轉染做類似處理。實驗以pcDNA3.1空載體轉染作為對照組，pcDNA3.1-PCNA或pSilencer-shPCNA轉染為實驗組。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結果以s表示，同一時間點對照組和實驗組細胞凋亡率(或存活率)比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 轉染pcDNA3.1-PCNA載體后PCNA基因的表達情況 通過Anti-Myc抗體檢測發(fā)現(xiàn)，轉染pcDNA3.1空載體的對照組未檢測到PCNA表達，轉染pcDNA3.1-PCNA的實驗組中檢測到PCNA高表達(圖1)。

2.2 轉染pSilencer-shPCNA載體后PCNA基因mRNA的表達 TCA8113細胞轉染pSilencershPCNA后48h，其mRNA水平(35.7%±10.0%)明顯低于對照組(轉染pSilencer空載體)的mRNA水平(93.3%±14.0%，P=0.006)。

圖1 轉染pcDNA3.1-PCNA高表達載體后PCNA基因的表達Fig.1 PCNA gene expression after transfection by hyper expressed pcDNA3.1-PCNA

2.3 PCNA基因高表達對TCA8113細胞增殖的影響MTT檢測結果顯示，隨著時間延長，實驗組或對照組細胞的存活率逐漸增高，對照組24、48、72、96h細胞存活率分別為45.1%±2.2%、52.1%±2.3%、60.2%±3.1%、69.4%±2.8%，實驗組24、48、72、96h細胞存活率分別為49.7%±1.5%、64.2%±2.9%、68.8%±2.6%、74.4%±2.5%，除96h外，兩組同一個時間點間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2)。

圖2 PCNA基因高表達對TCA8113細胞存活率的影響Fig.2 Effect of hyper expression of PCNA on survival of TCA8113 cells

2.4 PCNA基因沉默對TCA8113細胞增殖的影響MTT檢測結果顯示，隨著時間延長，實驗組或對照組的細胞存活率逐漸增高，對照組24、48、72、96h細胞存活率分別為48.5%±2.1%、58.2%±2.3%、65.6%±3.5%、70.4%±2.5%，PCNA沉默組24、48、72、96h細胞存活率分別為43.1%±1.4%、50.2±1.5%、55.8±2.1%、63.4±2.4%，兩組同一個時間點間比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖3)。

2.5 PCNA基因高表達對順鉑誘導TCA8113細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測結果顯示，未用順鉑處理的情況下，對照組細胞凋亡率為13%，而PCNA高表達后細胞凋亡率明顯降低(7%，P=0.030)；應用順鉑處理的情況下，PCNA高表達組的TCA8113細胞凋亡率(16%)亦明顯低于對照組(41%，P=0.011，圖4)。

圖3 PCNA基因沉默對TCA8113細胞存活率的影響Fig.3 Effect of PCNA silence on survival of TCA8113 cells

圖4 PCNA基因高表達對順鉑誘導的TCA8113細胞凋亡的抑制作用Fig.4 Inhibition effect of PCNA hyper expression on apoptosis of TCA8113 cells induced by cisplatin

2.6 PCNA基因沉默對順鉑誘導TCA8113細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測結果顯示，無順鉑處理的情況下，PCNA沉默后細胞凋亡率(24%)與對照組(15%)比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.248)；采用順鉑處理后，PCNA沉默組TCA8113細胞凋亡率(66%)明顯高于對照組(36%，P=0.001，圖5)。

圖5 PCNA基因沉默對順鉑誘導的TCA8113細胞凋亡的促進作用Fig.5 Promotion effect of PCNA silence on apoptosis of TCA8113 cells induced by cisplatin

3 討 論

PCNA基因是人DNA復制復合體的核心組分，具有特殊的環(huán)狀結構，可推動DNA復制，且PCNA基因能夠與多種細胞內分子結合，參與細胞周期調控、DNA損傷修復、DNA甲基化、染色體重塑等多種重要功能[5,15]。此外，PCNA與細胞凋亡及增殖密切相關，已有多項研究報道PCNA在腫瘤如胃癌、肺癌、結直腸癌、胰腺癌以及多種婦科腫瘤中呈高表達[8-9]。PCNA的異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，可用于評估腫瘤的惡性程度及增殖潛能，且在不同時期的腫瘤中具有不同的表達水平[8]。最近有多篇文獻報道了PCNA在口腔鱗癌中呈異常表達，而在正?？谇火つぜ毎胁槐磉_[11-12]，推測PCNA基因可能與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關，對其進行研究可加深對PCNA基因本身以及口腔鱗癌的理解，并且PCNA可能作為口腔鱗癌治療的一個潛在靶點[3,16]。

本研究以TCA8113口腔鱗癌細胞作為研究對象，構建pcDNA3.1-PCNA高表達載體和pSilencershPCNA基因沉默載體，通過基因轉染高表達PCNA或者沉默PCNA基因，再檢測分析PCNA對口腔鱗癌細胞增殖和凋亡的影響。我們采用Western blotting檢測驗證了高表達的有效性，同時，采用熒光定量PCR結果驗證了基因沉默的有效性，轉染pSilencer-shPCNA的實驗組PCNA mRNA表達水平顯著下調。

腫瘤的發(fā)生源于細胞的異常增殖，本研究利用PCNA高表達或基因沉默，進一步檢測PCNA基因對TCA8113細胞增殖的影響。MTT實驗是檢測細胞增殖的常用方法，本研究設置了不同的時間點，通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)PCNA基因高表達可促進TCA8113細胞的增殖(P＜0.05)，而沉默PCNA基因可抑制TCA8113細胞的增殖(P＜0.05)。為了進一步驗證PCNA基因與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的關系，并探討其初步機制，本研究采用Annexin V/PI染色法檢測了PCNA高表達和低表達對細胞凋亡的影響，結果顯示在TCA8113細胞凋亡過程中，PCNA高表達抑制了凋亡(對照組細胞凋亡率為13%，PCNA高表達后細胞凋亡率降低到7%)，而PCNA沉默則促進了凋亡(PCNA沉默后細胞凋亡率為24%，對照組的細胞凋亡率為15%)。因此，推測PCNA基因的異常表達與口腔鱗癌細胞系的增殖有關。

化療藥物可殺傷腫瘤細胞，是目前治療腫瘤的主要手段之一。近來的研究表明，化療藥物主要作用于腫瘤細胞生長的不同環(huán)節(jié)上(抑制增殖或直接誘導腫瘤細胞凋亡)[17-18]，但是腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性也是目前亟待解決的難題。文獻報道PCNA基因在口腔鱗癌中高表達，而在正常的口腔黏膜細胞中不表達[11-12]，本研究也證實PCNA基因參與了TCA8113口腔鱗癌細胞的增殖和凋亡通路。因此，我們設想PCNA基因可能作為腫瘤治療的潛在靶點，可以通過干擾PCNA基因的表達來影響其凋亡或增殖通路，從而增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，提高治療效果[3,16]。順鉑是常用的化療藥物，本研究采用順鉑來誘導口腔鱗癌細胞凋亡，結果發(fā)現(xiàn)，在順鉑誘導TCA8113細胞凋亡的過程中，PCNA高表達可抑制凋亡(對照組凋亡率為41%，PCNA高表達組為16%)，而PCNA沉默可促進凋亡(對照組凋亡率為36%，PCNA沉默組為66%)，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，該結果證實干擾PCNA基因可增強順鉑對口腔鱗癌細胞的殺傷效果，初步表明PCNA基因作為潛在靶點是可行的，但仍需進一步深入研究。

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