重癥中暑腸淋巴激活血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性活性的研究

童華生，段鵬凱，張興欽，安曉慶，萬鵬，唐柚青，蘇磊

新近研究認(rèn)為在多種重癥疾患應(yīng)激早期，腸源性毒性物質(zhì)即可通過腸系膜淋巴途徑直接誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)并引起內(nèi)臟器官損害[1-2]，本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)重癥中暑腸淋巴可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)，致其損傷[3]。更為重要的是目前研究已發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是重癥中暑多臟器功能損害發(fā)病的關(guān)鍵病理生理機(jī)制，血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥活性的激活是其中的重要環(huán)節(jié)之一，內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)的同時表達(dá)相關(guān)細(xì)胞黏附分子可促進(jìn)炎癥細(xì)胞的黏附、浸潤進(jìn)而造成組織炎癥損傷[4-6]。本研究通過觀察重癥中暑腸淋巴對血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥活性的影響，深入探討重癥中暑的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 重癥中暑大鼠模型制備 由于雌激素對熱損傷具有保護(hù)作用[7]，本實驗采用體重220～250g雄性Wistar大鼠，3%戊巴比妥鈉(lml/kg)腹腔注射麻醉，固定于手術(shù)臺。按照本課題組前期建立的方法制備重癥中暑動物模型[3,8]，觀察大鼠在高溫高濕環(huán)境熱暴露狀態(tài)下生命體征的變化趨勢。模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)：持續(xù)熱暴露狀態(tài)下，動物中心體溫達(dá)42℃以上，平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)從峰值下降25mmHg即為發(fā)生重癥中暑[3,9]。

1.2 腸系膜淋巴液引流收集 將全腸道及網(wǎng)膜組織掀起，暴露腸系膜上動脈及腸系膜淋巴管，于近腹主動脈處剪開漿膜，鈍性分離腸系膜上動脈及腸系膜淋巴干；輕提腸系膜淋巴干，在其上用眼科剪剪一小口，待少量淋巴液流出，用眼科鑷夾持45°斜面硅膠導(dǎo)管于開口處順淋巴管走向緩慢送入3～7mm；用少量醫(yī)用膠涂抹于右腎旁漿膜處固定導(dǎo)管，分別收集熱暴露前(Pre-HS)、熱暴露期間(During-HS)和重癥中暑后(Post-HS)的大鼠腸淋巴液。

1.3 ECV-340細(xì)胞的培養(yǎng)及處理 取對數(shù)期臍靜脈內(nèi)皮ECV-340細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640液接種于96孔板培養(yǎng)，5×104/ml，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)，換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h。分別加入5% Pre-HS、During-HS和Post-HS腸淋巴液孵育3、6h，每組設(shè)6個復(fù)孔。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清用于炎癥介質(zhì)檢測。由于實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱暴露后腸淋巴孵育ECV-340細(xì)胞6h后，ECV-340細(xì)胞炎性分泌活性明顯，因此只檢測腸淋巴孵育6h時的ICAM-1 mRNA表達(dá)和NF-κB活性水平。

1.4 炎癥介質(zhì)檢測 采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清高水平高遷移率族蛋白B1(Shino-Test Corporation，Sagamihara，HMGB1)、腫瘤壞死因子α(TNF α)、白介素1β(IL-1β)和IL-6水平，操作按說明書進(jìn)行。

1.5 ICAM-1 mRNA表達(dá)檢測 采用Trizol試劑盒提取ECV-340細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。細(xì)胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1)引物：正義5'-AACTTTTCAGCTCCGGTCCTG-3'，反義5'-TCAGTGTGAATTGGACCTGCG-3'。采用PCR試劑盒擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 50s，共35個循環(huán)；72℃ 8min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂凝膠電泳，采用Image J 2.1.4.7進(jìn)行圖像分析處理。

1.6 NF-κB水平檢測 采用細(xì)胞核蛋白試劑盒(江蘇碧云天)提取ECV-340細(xì)胞核蛋白，采用TransFactor Profiling Kit-Inflammation試劑盒(BD Biosciences)檢測核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)的活性，上樣量為40μg，具體操作按說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 15.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用s表示，多組間比較采用Oneway ANOVA分析，兩組間比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重癥中暑腸淋巴誘導(dǎo)ECV-340細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì) ELISA法檢測結(jié)果顯示，熱暴露前腸淋巴處理ECV-340細(xì)胞不分泌HMGB1，低水平分泌IL-6、IL-1β、TNF-α，而熱暴露后，即During-HS和Post-HS情況下腸淋巴可誘導(dǎo)ECV-340細(xì)胞HMGB1、IL-6、IL-1β、TNF-α分泌增加(P＜0.05或P＜0.01)，且誘導(dǎo)效應(yīng)隨著熱暴露時間的延長而呈時間依賴性增強(qiáng)(P＜0.05，圖1)。

2.2 重癥中暑腸淋巴誘導(dǎo)ECV-340細(xì)胞ICAM-1、NF-κB表達(dá)情況 熱暴露后腸淋巴孵育6h后，ECV-340細(xì)胞ICAM-1 mRNA、NF-κB表達(dá)均增加(P＜0.05或P＜0.01)，且誘導(dǎo)效應(yīng)隨著熱暴露時間的延長也呈時間依賴性增強(qiáng)(P＜0.05，圖2)。

3 討 論

腸道是眾多危重疾病病理生理過程的扳機(jī)點，高熱應(yīng)激致腸源性毒素血癥是驅(qū)動重癥中暑發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，而基于血管內(nèi)皮損傷的病理效應(yīng)是重癥中暑發(fā)生、發(fā)展的平臺。重癥中暑時腸源性毒性物質(zhì)進(jìn)入循環(huán)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷，啟動全身炎癥反應(yīng)，致凝血功能紊亂，這是重癥中暑發(fā)病的根本機(jī)制[1-3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，重癥中暑腸淋巴途徑可能是重癥中暑腸源性毒性產(chǎn)物誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷的橋梁[3]，但有關(guān)腸淋巴對血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性活性的影響，尚未見報道。

在熱應(yīng)激狀態(tài)下，腸道血管收縮會導(dǎo)致缺血缺氧改變進(jìn)而使腸黏膜通透性增加，促使腸源性毒性因子進(jìn)入腸淋巴管，產(chǎn)生全身性病理損害效應(yīng)[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，During-HS腸淋巴可誘導(dǎo)ECV-340細(xì)胞呈時間依賴性分泌高水平IL-1β、IL-6、TNF-α和HMGB1，而Post-HS腸淋巴的誘導(dǎo)效應(yīng)更為明顯，提示熱應(yīng)激早期腸淋巴即可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放炎性因子，且隨著熱應(yīng)激時間的延長，腸淋巴毒性效應(yīng)愈為明顯。本研究也表明，血管內(nèi)皮是重癥中暑炎癥反應(yīng)的重要效應(yīng)環(huán)節(jié)之一，這與既往研究結(jié)果一致[4-6]。早期炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6和TNF-α可進(jìn)一步激活機(jī)體組織和全身性炎癥反應(yīng)，參與重癥中暑全身炎性反應(yīng)的發(fā)病過程且與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)[13]。

圖1 重癥中暑腸淋巴誘導(dǎo)ECV-340細(xì)胞炎性介質(zhì)分泌的ELISA檢測Fig.1 Secretion of inflammatory mediators of ECV-340 cells induced by severe heatstroke mesenteric lymph (ELISA)

圖2 重癥中暑腸淋巴對ECV-340細(xì)胞ICAM-1、NF-κB表達(dá)的誘導(dǎo)作用Fig.2 Induction effect of severe heatstroke mesenteric lymph on ICAM-1 mRNA and NF-κB expression of ECV-340 cells

盡管HMGB1是一種參與膿毒癥發(fā)病的晚期炎癥介質(zhì)，但其在重癥中暑動物模型的熱應(yīng)激早期即可出現(xiàn)[14-16]，更為重要的是HMGB1可在體內(nèi)長時間高水平存在，可能在重癥中暑持續(xù)性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是重癥中暑發(fā)病的關(guān)鍵性因子之一[17-18]。與腸淋巴誘導(dǎo)血管內(nèi)皮炎性分泌效應(yīng)一致的是，本研究還發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激腸淋巴可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮ICAM-1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。ICAM-1作為血管內(nèi)皮與炎癥細(xì)胞黏附的重要分子，可能介導(dǎo)多種炎性細(xì)胞向組織、器官定向轉(zhuǎn)移、浸潤，參與重癥中暑炎癥的發(fā)生和發(fā)展[19]。NF-κB是細(xì)胞炎性反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子，被激活后可導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子、黏附分子以及許多其他調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄凋亡的基因表達(dá)，進(jìn)而參與機(jī)體炎性反應(yīng)[20]。已有研究表明，腸淋巴誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷是基于NF-κB途徑的[21]，但重癥中暑腸淋巴激活血管內(nèi)皮炎癥效應(yīng)是否通過NF-κB途徑目前尚不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重癥中暑腸淋巴可明顯激活血管內(nèi)皮NF-κB活性，且血管內(nèi)皮NF-κB活性與其炎癥效應(yīng)增加趨勢一致，提示重癥中暑腸淋巴激活血管內(nèi)皮炎性效應(yīng)可能是基于NF-κB途徑。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，重癥中暑病程中腸淋巴可激活血管內(nèi)皮炎癥效應(yīng)，且這種毒性激活效應(yīng)隨著熱應(yīng)激時間的延長而增強(qiáng)，提示基于腸淋巴途徑的腸源性毒性物質(zhì)和血管內(nèi)皮構(gòu)成了重癥中暑的關(guān)鍵發(fā)病環(huán)節(jié)，NF-κB可能參與了熱應(yīng)激腸淋巴激活血管內(nèi)皮炎癥效應(yīng)的分子通路，但仍需進(jìn)一步研究證實。

[1]Gabriela C, Helori VD, Alexandre LS, et al. Lymphatic system as a path underlying the spread of lung and gut injury after intestinal isehemia/reperfusion in rats[J]. Shock, 2005, 23(4):330-336.

[2]Spindler-Vesel A, Wraber B, Vovk I, et al. Intestinal permeability and cytokine inflammatory response in multiply injured patients[J]. J Interferon Cytokine Res, 2006, 26(10): 771-776.

[3]Tong H, Wan P, Zhang X, et al. Vascular endothelial cell injury partly induced by mesenteric lymph in heat stroke[J].Inflammation, 2014, 37(1): 27-34.

[4]Bouchama A, Knochel JP. Heat stroke[J]. N Engl J Med, 2002,346(25): 1978-1988.

[5]Bouchama A, Kunzelmann C, Dehbi M, et al. Recombinant activated protein C attenuates endothelial injury and inhibits procoagulant microparticles release in baboon heatstroke[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2008, 28(7): 1318-1325.

[6]Roberts GT, Ghebeh H, Chishti MA, et al. Microvascular injury,thrombosis, inflammation, and apoptosis in the pathogenesis of heatstroke: a study in baboon model[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2008, 28(6): 1130-1136.

[7]Chen SH, Chang FM, Niu KC, et al. Resuscitation from experimental heatstroke by estrogen therapy[J]. Crit Care Med,2006, 34(4): 1113-1118.

[8]Tong HS, Duan PK, Zhang XX, et al. Changes in mesenteric lymph microcirculation in rats suffering from severe heatstroke[J]. Med J Chin PLA, 2014, 39(4): 329-332. [童華生,段鵬凱, 張興欽,等. 重癥中暑大鼠腸系膜淋巴微循環(huán)變化[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 39(4): 329-332.]

[9]Chen SH, Chang FM, Chang HK, et al. Human umbilical cord blood-derived CD34+cells cause attenuation of multiorgan dysfunction during experimental heat stroke[J]. Shock, 2007,27(6): 663-671.

[10]Lu KC, Wang JY, Lin SH, et al. Role of circulating cytokines and chemokines in exertional heatstroke[J]. Crit Care Med, 2004,32(2): 399-403.

[11]Senthil M, Watkins A, Barlos D, et al. Intravenous injection of trauma-hemorrhagic shock mesenteric lymph causes lung injury that is dependent upon activation of the inducible nitric oxide synthase pathway [J]. Ann Surg, 2007, 246(5): 822-830.

[12]Xu DZ, Lu Q, Adams CA, et al. Trauma-hemorrhagic shockinduced up-regulation of endothelial cell adhesion molecules is blunted by mesenteric lymph duct ligation[J]. Crit Care Med,2004, 32(3): 760-765.

[13]Leon LR, Helwig BG. Heat stroke: role of the systemic inflammatory response[J]. J Appl Physiol, 2010, 109(6): 1980-1988.

[14]Hagiwara S, Iwasaka H, Goto K, et al. Recombinant thrombomodulin prevents heatstroke by inhibition of highmobility group box 1 protein in sera of rats[J]. Shock, 2010,34(4): 402-406.

[15]Hagiwara S, Iwasaka H, Shingu C, et al. High-dose antithrombin III prevents heat stroke by attenuating systemic inflammation in rats[J]. Inflamm Res, 2010, 59(7): 511-518.

[16]Tong HS, Duan PK, Zhang XQ, et al. Mechanism of HMGB1 secretion from THP-1 cells induced by double insults of heat and LPS [J]. Med J Chin PLA, 2014, 39(8): 640-644. [童華生, 段鵬凱, 張興欽, 等. 熱聯(lián)合內(nèi)毒素打擊對THP-1細(xì)胞HMGB1分泌的誘導(dǎo)作用研究[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 39(8): 640-644.]

[17]Tong HS, Tang YQ, Chen Y, et al. Early elevated HMGB1 level predicting the outcome in exertional heatstroke[J]. J Trauma,2011, 71(4): 808-814.

[18]Tong HS, Tang Y, Chen Y, et al. HMGB1 activtiy inhibition alleviating Liver injury in heatstroke[J]. J Trauma Acute Care Surg, 2013, 74(3): 801-807.

[19]Hossain M, Qadri SM, Su Y, et al. ICAM-1-mediated leukocyte adhesion is critical for the activation of endothelial LSP1[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2013, 304(9): 895-904.

[20]Wu JF, Niu J, Li XP, et al. Effect of angiotensin Ⅱ on inflammatory responses of mouse bone marrow mesenchymal stem cell mediated by ERK1/2 and NF-κB pathways[J]. J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2014, 49(4): 465-468. [武俊芳, 牛杰, 李曉鵬, 等. 血管緊張素Ⅱ?qū)π∈蠊撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞中ERK1/2 和NF-κB信號途徑介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2014, 49(4): 465-468.]

[21]Damle SS, Moore EE, Nydam TL, et al. Post-shock mesenteric lymph induces endothelial NF-κB activation[J]. J Surg Res,2007, 143(1): 136-140.