一氧化氮處理對(duì)香蕉多聚半乳糖醛酸酶及MaPGs基因表達(dá)的影響

吳 斌， 郭 芹， 王剛霞， 陳維信， 李雪萍＊

1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東省果蔬保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；

2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，烏魯木齊 830091；

3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮與物流研究室，北京 100193

香蕉（Musaspp.cv.Brazil）是典型的呼吸躍變型果實(shí)，在采后很短的時(shí)間會(huì)發(fā)生大量的生理生化變化［1］，硬度、外觀、風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值都會(huì)降低。因此，該果實(shí)的貨架期較短。軟化是香蕉成熟過(guò)程的一個(gè)顯著變化，制約了香蕉的市場(chǎng)銷售。研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致軟化的主要原因是細(xì)胞壁軟化酶的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，例如果膠甲酯酶（PME）、多聚半乳糖醛酸酶 （PG）、果膠裂解酶（PL）和纖維素酶 （Cx）［2～4］等。其中，PG的主要功能是降解細(xì)胞壁和果膠成分，對(duì)果實(shí)的成熟軟化起重要作用［5，6］，但其具體作用機(jī)理尚不清楚。目前，雖然已在香蕉果實(shí)中克隆到4個(gè)PG家族基因［3，7］，但是從基因表達(dá)揭示調(diào)控作用機(jī)制的研究報(bào)道較少，通常采用熱處理、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和化學(xué)添加劑等［3，8］調(diào)控香蕉果實(shí)的采后軟化。

一氧化氮（NO）作為一種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可控制許多植物的生長(zhǎng)、成熟和抗病性［9～11］，但對(duì) NO在采后香蕉果實(shí)貯藏中的研究報(bào)道較少。本研究以‘巴西’香蕉為試材，研究NO處理果實(shí)中PG活性及MaPGs基因表達(dá)的變化，探討NO延緩香蕉果實(shí)軟化的分子作用機(jī)理，為進(jìn)一步深入研究NO在果蔬采后的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的香蕉品種為‘巴西’（Musa spp.cv.‘Brazil’），2010年10月采自廣州市番禺寶升生態(tài)農(nóng)場(chǎng)，采后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，選取成熟度一致（綠熟）、大小均一、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械傷的果實(shí)，用2g／L強(qiáng)力溶液浸泡10min，再用500μL／L的抑菌鮮浸果1min，晾干備用。

NO氣體，純度99.9%，購(gòu)自廣州市世源氣體有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2014C型氣相色譜儀，日本島津公司；UV-2450型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；3k15型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)SIGMA公司；5542型果蔬材料硬度測(cè)試機(jī)，美國(guó)INSTRO公司；iCycleriQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 處理方法

在20℃條件下，將香蕉置于密封箱內(nèi)（30.8L），進(jìn)行 NO 處理，具體操作參照郭芹等［10］方法，在無(wú)氧 N2環(huán)境下，通入40μL／L NO氣體，熏蒸3h，處理完后裝入厚度為0.03mm的保鮮袋內(nèi)裝箱，在20±1℃、相對(duì)濕度85%條件下貯藏。對(duì)照組通入N2維持3h，其他條件不變。各處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)60個(gè)果實(shí)。

1.4 乙烯和硬度的測(cè)定

各處理分別取5個(gè)果實(shí)，在20℃條件下密封2h后抽取氣體測(cè)定乙烯釋放量。乙烯含量采用GC-2014C型氣相色譜儀測(cè)定，色譜條件為：采用不銹鋼色譜柱，柱溫80℃，進(jìn)樣口溫度140℃，氫火焰離子檢測(cè)器（FID）溫度150℃，氣體樣品進(jìn)樣量1mL。重復(fù)3次取平均值，以μL／h·kg·FW表示。硬度測(cè)定采用5542型果蔬材料硬度測(cè)試機(jī)測(cè)定，探頭直徑為8mm。以300mm／min速度在每果赤道線均勻測(cè)5個(gè)點(diǎn)，最大硬度值用牛頓（N）表示，取平均值。

1.5 多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性的測(cè)定

多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性參照Guo等［12］的方法測(cè)定，以每分鐘每克鮮樣37℃時(shí)分解果膠產(chǎn)生1μg游離半乳糖醛酸定義為一個(gè)果膠酶活性單位（U）。

1.6 RNA提取和cDNA合成

采用 TRIzol試劑盒（Invitrogen，上海，中國(guó)）提取香蕉果實(shí)總RNA，RNA的完整性通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳確定。cDNA的合成參照Guo等［12］方法。

1.7 MaPGs基因表達(dá)量實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

使用iCycler iQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系（20.0μL）為：10.0μL SYBR?qPCR Mix，2.0μL cDNA，6.0μL ddH2O，上下游引物各1.0 μL（引物濃度10μmol／L）。運(yùn)行程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，50℃退火10s，72℃延伸10s，40次循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

以香蕉Actin基因（登錄號(hào)為：AF246288.1）作為內(nèi)參，參照MaPGs基因序列設(shè)計(jì)特異性引物。引物對(duì)為：MaPG1-F：5′-TGTCGTCGGTCTCATCAA-3′，MaPG1-R：5′-GGTGCATTCCATGTGTATTC-3′，（登錄號(hào)：AF311881）；MaPG2-F：5′-TCATTACAGCATTGAAGGGAAA-3′，MaPG2-R：5′-GTCAAGTTATTTGGGGTGCATT-3′，（登錄號(hào)：AF311882）；MaPG3-F：5′-GCACCCAACATCACTCTATC-3′，MaPG3-R：5′-AGGGAATCGTCAGCGTCT-3′，（登錄號(hào)：AY603339.1）；MaPG4-F：5′-GTATTGGAAGCTTAGGAAAGCAG-3′，MaPG4-R：5′-ACGGTGTCCATGCGTATGTT-3′， （登錄號(hào)：AY603341）；Actin-F：5′-GAGAAGATACAGTGTCTGGA-3′， Actin-R： 5′-ATTACCATCGAAATATTAAAAG-3′。采用姜妮娜等［6］方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與作圖

使用SigmaPlot 12.0（Systat Software Inc.，San Jose，CA，USA）軟件作圖；使用SPSS 16.0（Version 16.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）在P＝0.05水平進(jìn)行顯著性（LSD）分析。測(cè)得值均以平均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)誤 （S.E.）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 NO處理對(duì)香蕉果實(shí)乙烯釋放量的影響

乙烯在果實(shí)成熟過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，這種作用通過(guò)乙烯生成量的增加和組織對(duì)乙烯敏感性的改變而實(shí)現(xiàn)。從圖1可知：香蕉果實(shí)在貯藏前5d都無(wú)乙烯產(chǎn)生，從第16d開(kāi)始對(duì)照果實(shí)乙烯釋放量迅速增加，在第23d達(dá)到最大值，之后開(kāi)始下降。NO處理果在貯藏的前23d乙烯釋放量較低，在第25d達(dá)到最大值，是對(duì)照果峰值的0.77倍。結(jié)果表明，NO處理可降低香蕉果實(shí)乙烯釋放量，延緩乙烯峰值的出現(xiàn)。

圖1 NO處理對(duì)香蕉果實(shí)乙烯釋放量的影響 Fig.1 Effect of NO treatment on ethylene production of banana fruit.

2.2 NO處理對(duì)香蕉果實(shí)硬度的影響

果實(shí)硬度是判斷果實(shí)質(zhì)地、反映果實(shí)貯藏性和衡量貯藏效果的主要指標(biāo)。香蕉果實(shí)硬度在采后前21d下降緩慢，之后迅速下降，表明在此階段果實(shí)快速軟化，與乙烯的迅速釋放量相一致。NO處理香蕉果實(shí)硬度的變化與對(duì)照相似，前期隨著乙烯的緩慢釋放逐漸下降，之后隨著乙烯峰值的出現(xiàn)迅速下降，但在貯藏過(guò)程中硬度明顯高于對(duì)照，在第27d果實(shí)的硬度是8.88N，約是對(duì)照（1.80N）的5倍（圖2）。結(jié)果表明，NO處理顯著抑制了乙烯的生成，從而延緩了香蕉果實(shí)硬度的下降，尤其在貯藏后期效果較為顯著。

圖2 NO處理對(duì)香蕉果實(shí)硬度的影響 Fig.2 Effect of NO treatment on firmness of banana fruit.

2.3 NO處理對(duì)香蕉果實(shí)多聚半乳糖醛酸酶（PG）的影響

多聚半乳糖醛酸酶在水果細(xì)胞壁的降解和軟化過(guò)程起著重要作用。從圖3可知，對(duì)照香蕉果實(shí)的PG活性從第0d的0.37U／g·min·FW 逐漸增加到第21d的0.94U／g·min·FW，之后開(kāi)始下降。NO處理果PG活性在貯藏過(guò)程低于對(duì)照果，尤其是貯藏后期顯著低于對(duì)照。

圖3 NO處理對(duì)香蕉果實(shí)PG活性的影響 Fig.3 Effect of NO treatment on PG activity of banana fruit.

2.4 NO處理對(duì)香蕉果實(shí)MaPG1基因表達(dá)的影響

從圖4可知，在香蕉的貯藏過(guò)程，對(duì)照果與NO處理果MaPG1基因表達(dá)的變化趨勢(shì)相似，隨著果實(shí)中PG活性的增加，MaPG1基因表達(dá)水平也逐漸增加，在第21d達(dá)到最大值，之后隨著PG活性的下降逐漸降低，但NO處理果MaPG1的表達(dá)水平在貯藏過(guò)程與對(duì)照果無(wú)顯著差異。

圖4 NO處理對(duì)香蕉果實(shí)MaPG1基因表達(dá)的影響 Fig.4 Effect of NO treatment on the expression of MaPG1 of banana fruit.

2.5 NO處理對(duì)香蕉果實(shí)MaPG2基因表達(dá)的影響

對(duì)照香蕉果實(shí)MaPG2基因表達(dá)水平在貯藏過(guò)程逐漸增加，在第21d達(dá)到最大，之后開(kāi)始下降，而NO處理的香蕉果實(shí)MaPG2基因表達(dá)水平在貯藏前13d與對(duì)照無(wú)顯著差異，之后MaPG2基因表達(dá)水平顯著低于對(duì)照（圖5），說(shuō)明NO對(duì)香蕉果實(shí)MaPG2基因表達(dá)有一定的抑制作用。

圖5 NO處理對(duì)香蕉果實(shí)MaPG2基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of NO treatment on the expression of MaPG2 of banana fruit.

2.6 NO處理對(duì)香蕉果實(shí)MaPG3基因表達(dá)的影響

對(duì)照果與NO處理果MaPG3基因在香蕉果實(shí)的貯藏前13d表達(dá)較弱，從第16d開(kāi)始對(duì)照香蕉果實(shí)MaPG3基因表達(dá)量迅速增加，在第23d達(dá)到最大值。NO處理的香蕉果實(shí)MaPG3基因在第25d才有較高的表達(dá)，說(shuō)明NO可顯著抑制貯藏過(guò)程香蕉果實(shí)MaPG3基因的表達(dá)。

圖6 NO處理對(duì)香蕉果實(shí)MaPG3基因表達(dá)的影響 Fig.6 Effect of NO treatment on the expression of MaPG3 of banana fruit.

2.7 NO處理對(duì)香蕉果實(shí)MaPG4基因表達(dá)的影響

從圖7可知，在貯藏過(guò)程中，香蕉果實(shí)的MaPG4基因在貯藏的前16d表達(dá)較弱，與低的乙烯釋放量相一致，之后隨著乙烯的迅速釋放MaPG4基因的表達(dá)量急劇增加，在第23d達(dá)到最大，之后開(kāi)始下降。NO處理果MaPG4基因在貯藏的前23d都表達(dá)較弱，隨著乙烯峰值的出現(xiàn)表達(dá)量在第25d迅速增加。說(shuō)明NO可顯著抑制香蕉果實(shí)貯藏過(guò)程MaPG4基因的表達(dá)，并延緩基因表達(dá)峰值的出現(xiàn)。

圖7 NO處理香蕉果實(shí)MaPG4基因表達(dá)的影響 Fig.7 Effect of NO treatment on the expression of MaPG4 of banana fruit.

3 討論

香蕉果實(shí)軟化是成熟衰老過(guò)程的重要特征，直接影響到果實(shí)的采后貯藏和商品價(jià)值。本研究的結(jié)果表明NO可顯著抑制香蕉果實(shí)乙烯的生成，延緩硬度的下降，與NO對(duì)番茄、番木瓜、草莓的研究結(jié)果相一致［10，13，14］。已有研究表明 NO 可通過(guò)抑制果實(shí)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）氧化酶（ACO）的活性及CpACO1基因的表達(dá)量來(lái)降低乙烯釋放量［15］，從而延緩硬度的下降［12］，這可能是NO與ACO反應(yīng)生成ACO-NO配合物，再與ACC反應(yīng)形成ACC-ACO-NO配合物，阻止了乙烯的產(chǎn)生。但也有研究發(fā)現(xiàn)果實(shí)成熟過(guò)程乙烯釋放量的降低是由于NO與ACC合成酶（ACS）發(fā)生硝基化反應(yīng)從而抑制了ACS的活性［16］。這些結(jié)果表明：NO降低乙烯釋放量的機(jī)理可能還與果實(shí)的種類有關(guān)。

乙烯的迅速釋放會(huì)加快果實(shí)的軟化，果實(shí)的軟化與細(xì)胞壁中果膠物質(zhì)的增溶作用以及酶活性的變化有關(guān)［4，17］。香蕉果實(shí)軟化是細(xì)胞壁中層結(jié)構(gòu)變化，大量細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)喪失以及細(xì)胞壁物質(zhì)降解，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生分離所致。PG是導(dǎo)致細(xì)胞壁、果膠降解的主要因素，在果實(shí)成熟軟化過(guò)程中起重要作用［6］，PG活性的變化與乙烯及其合成相關(guān)酶的變化趨勢(shì)一致，對(duì)果實(shí)的快速軟化產(chǎn)生較大的影響［4，15］。本研究結(jié)果表明NO處理可延緩香蕉貯藏過(guò)程PG活性的增加，與Guo等［4］在番木瓜中的研究一致。PGs可以催化番茄果實(shí)中果膠分子β-（1，4）-聚半乳糖醛酸的裂解，從而參與果膠的降解，促進(jìn)果實(shí)軟化。NO可能是抑制了PG活性，從而阻止了果實(shí)細(xì)胞壁多糖中多聚半乳糖醛酸降解為半乳糖醛酸，維持了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性。但是，對(duì)反義PG轉(zhuǎn)基因番茄及成熟變異植株的研究發(fā)現(xiàn)，果實(shí)的硬度并非隨PG活性及果膠的降解而變化，或者在抑制PG活性的情況下果實(shí)仍然變軟［18］，說(shuō)明PG在果實(shí)成熟軟化過(guò)程不是單獨(dú)起作用，而是與軟化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中其它物質(zhì)相互影響共同決定著果實(shí)的軟化［4］。

PG基因的表達(dá)受乙烯調(diào)控，乙烯可以誘導(dǎo)綠熟期番茄PG mRNA的積累［6］。Wei等［19］研究發(fā)現(xiàn)乙烯利處理金冠蘋(píng)果，PG基因表達(dá)量顯著增加，且峰值極顯著高于對(duì)照。Hiwasa等［20］發(fā)現(xiàn)丙烯能促進(jìn)梨果實(shí)乙烯的產(chǎn)生、PG基因的大量表達(dá)以及果實(shí)的快速軟化。本研究中發(fā)現(xiàn)NO處理的香蕉果實(shí)與對(duì)照相比，乙烯釋放量明顯降低，前期MaPGs基因表達(dá)量都很低，MaPG2、MaPG3和MaPG4基因表達(dá)峰值顯著低于對(duì)照，出現(xiàn)的時(shí)間也被推遲，這些結(jié)果表明NO可下調(diào)MaPG2、MaPG3和MaPG4基因的表達(dá)，但對(duì)MaPG1基因的表達(dá)水平無(wú)顯著影響，進(jìn)一步說(shuō)明MaPGs基因可能分別調(diào)控香蕉果實(shí)PG不同時(shí)期的表達(dá)，且這些基因的表達(dá)受乙烯調(diào)控，參與PG合成，但MaPG1基因?qū)ο憬豆麑?shí)軟化的影響不大。

40μL／L NO可降低‘巴西’香蕉果實(shí)乙烯釋放量、延緩果實(shí)硬度的下降，也可抑制PG活性及MaPG2、MaPG3和MaPG4基因的表達(dá)來(lái)延緩果實(shí)的軟化，但NO在香蕉果實(shí)軟化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的信號(hào)途徑還有待于進(jìn)一步的研究。

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