胰脂肪酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選

孫 菲， 鄭 榕， 楊煌建， 張祝蘭

福建省微生物研究所，福州 350007

肥胖癥是危害人類健康的全球性疾病。1997年，世界衛(wèi)生組織（World Health Oganization，WHO）已明確認(rèn)定肥胖是全球成年人最大的慢性疾病，被列為世界四大醫(yī)學(xué)社會(huì)問題之一。根據(jù)WHO 2011年公布的數(shù)據(jù)，2008年全球超重者達(dá)15億人，其中肥胖者5億人。衛(wèi)生部2004年統(tǒng)計(jì)資料表明，我國有2.6億人超重或肥胖，且肥胖患病率呈明顯上升趨勢(shì)。因此研究肥胖病因、開發(fā)安全有效的減肥藥物已成為世界關(guān)注的研究領(lǐng)域。

目前已開發(fā)應(yīng)用的減肥藥物大都作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有較強(qiáng)的副作用，如引起中樞神經(jīng)興奮（包括失眠、緊張、不安、噩夢(mèng)、易怒等）、血壓上升或下降以及心臟瓣膜病等［1～4］。因此，現(xiàn)在基本被禁用。胰脂肪酶抑制劑是迄今為止唯一不通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用的減肥藥物，它通過選擇性地抑制胃腸道內(nèi)的胰脂肪酶，減少脂肪的分解和吸收，從而達(dá)到控制體重的目的，對(duì)其他營養(yǎng)物質(zhì)的吸收無影響，副作用主要表現(xiàn)為胃腸道不適，安全性相對(duì)較高［5，6］。

胰脂肪酶抑制劑作用機(jī)理獨(dú)特，并有良好的減肥功效和較高的安全性，是當(dāng)前減肥藥物研究的主要方向。國外研究者對(duì)胰脂肪酶抑制劑的研究較早，已篩選到一系列的胰脂肪酶抑制劑，如Esterastin［7］、Ebelactone A、Ebelactone B［8］、Valiacton［9］、Lipstatin［10］、Panclicin A～E［11］等，并對(duì)它們的生物活性、生物合成機(jī)理、作用機(jī)制、分子結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行了研究。其中Lipstatin已由羅氏公司開發(fā)為減肥藥物賽尼可，是目前唯一的OTC（非處方藥）減肥藥物。國內(nèi)近年來也相繼從植物［12］、中藥［13～15］及微生物［16，17］中篩選到一些脂肪酶抑制劑。

本文通過建立高通量的胰脂肪酶抑制劑產(chǎn)生菌篩選模型對(duì)微生物進(jìn)行篩選，獲得具有胰脂肪酶抑制活性的菌株，同時(shí)對(duì)產(chǎn)生菌代謝產(chǎn)物對(duì)淀粉酶、蛋白酶的抑制活性進(jìn)行考察，使篩選獲得的胰脂肪酶抑制劑能夠較高選擇性地抑制脂肪酶活力，對(duì)淀粉酶、蛋白酶的活力影響很小，不影響人體對(duì)其他營養(yǎng)物質(zhì)，如對(duì)淀粉、蛋白質(zhì)的吸收，從而符合減肥藥物開發(fā)的要求［18］。應(yīng)用此模型對(duì)來源于土壤的千余株菌株進(jìn)行篩選，得到目標(biāo)菌株FIM-1013、FIL-19和FIMe-3，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要材料

豬胰脂肪酶、α-淀粉酶、蛋白酶購自Sigma公司；脂肪乳劑Intralipid購自B.Braun Mel-sungen AG公司（德國）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

高氏I號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g／L，NaCl 0.5g／L，KNO31g／L，K2HPO3·3H2O 0.5g／L，MgSO4·7H2O 0.5g／L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g／L，K2Cr2O70.25g／L，pH 7.4～7.6。

液體培養(yǎng)基用于搖瓶培養(yǎng)，裝液量60mL／500mL，轉(zhuǎn)速220r／min，28℃培養(yǎng)7d。

固體培養(yǎng)基添加瓊脂20g／L，分離平板28℃培養(yǎng)10d，斜面28℃培養(yǎng)7d。

1.3 方法

1.3.1 微生物的分離 土壤樣品采集于福建省福州市鼓山。將采集的土樣制成土樣懸液，梯度稀釋后涂布于高氏I號(hào)培養(yǎng)基分離平板上，28℃培養(yǎng)10d，挑取單菌落至斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7d。

1.3.2 菌株發(fā)酵液篩選的樣品制備 各分離菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。所得發(fā)酵液加入4倍體積的無水乙醇，振搖（攪拌）60min后，10 000r／min離心10min，取上清液作為脂肪酶抑制活性的測(cè)定樣品。空白對(duì)照樣品以搖瓶培養(yǎng)的原始培養(yǎng)基（高氏I號(hào)液體培養(yǎng)基）按上述方法制備。

1.3.3 胰脂肪酶抑制劑體外篩選模型的建立

根據(jù)姚朗等［19］方法建立胰脂肪酶抑制劑體外篩選模型。該模型以臨床注射用靜脈脂肪乳劑Intralipid作脂肪酶活性測(cè)定底物，以奧利司他作為陽性對(duì)照樣品。發(fā)酵液樣品（10μL）、胰脂肪酶（100μL）及靜脈脂肪乳劑Intralipid（70μL）35℃共同反應(yīng)30min后，比濁度發(fā)生變化，發(fā)酵液樣品的胰脂肪酶抑制能力與比濁度變化呈負(fù)相關(guān)，胰脂肪酶抑制能力越強(qiáng)則比濁度下降值越小。應(yīng)用酶標(biāo)儀，采用96孔比濁法于波長490nm測(cè)定比濁度，篩選出具有較強(qiáng)胰脂肪酶抑制能力的菌株。

1.3.4 淀粉酶、蛋白酶、胰脂肪酶抑制活性測(cè)定

分別用空白對(duì)照樣品和各分離菌株的發(fā)酵液樣品溶解淀粉酶、蛋白酶、胰脂肪酶酶粉，按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定發(fā)酵液對(duì)淀粉酶、蛋白酶、胰脂肪酶的抑制活性［20］。淀粉酶活力單位以l g酶粉在60℃、pH 6.0條件下，在1h內(nèi)液化可溶性淀粉的克數(shù)表示。酸性蛋白酶活力單位以1g酶粉在37℃、pH 5.5的條件下，每分鐘水解酪蛋白釋放酪氨酸微克數(shù)表示。胰脂肪酶活力是將每分鐘從底物中釋放出1μg小分子脂肪酸所用酶量定義為一個(gè)單位。淀粉酶、蛋白酶、胰脂肪酶活性測(cè)定結(jié)果運(yùn)用SPSS16.0（Statistical Program for Social Sciences，SPSS Corporation，Chicago，IL）數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析多重比較。酶抑制率計(jì)算公式如下：

式中，I表示酶活性抑制率（%）；A為酶標(biāo)準(zhǔn)活性（U）；B為抑制作用下酶活性（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 胰脂肪酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選

從土壤中分離1 000余株菌株，發(fā)酵后經(jīng)胰脂肪酶抑制劑篩選模型篩選，每株菌株樣品設(shè)置三個(gè)平行樣，用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品反應(yīng)前后OD值，計(jì)算OD值下降值。最終篩選得到11株胰脂肪酶抑制劑產(chǎn)生菌（表1），其中菌株FIRs-132、FITs-221為細(xì)菌，其余均為放線菌。其代謝產(chǎn)物均具有胰脂肪酶抑制能力，其中，菌株FIM-1013、FIB-17、FIL-19和FIMe-3（見圖1）的胰脂肪酶抑制能力優(yōu)于其他菌株。

2.2 菌株的淀粉酶抑制活性

對(duì)篩選到的11株胰脂肪酶抑制劑產(chǎn)生菌進(jìn)行淀粉酶抑制活性的測(cè)定，結(jié)果如表2所示，其中，菌株FIM-1013對(duì)淀粉酶無抑制活性；菌株FIL-19、FIMe-3、FIRs-132和FITs-221對(duì)淀粉酶的抑制活性極其微弱；菌株FINe-45、FIGr-116對(duì)淀粉酶抑制活性較強(qiáng)，達(dá)到50%以上。

表1 胰脂肪酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選 Table 1 Screening of pancrelipase inhibitor-producing strains.

圖1 胰脂肪酶抑制劑產(chǎn)生菌菌落形態(tài) Fig.1 The colonial morphology of pancrelipase inhibitor-producing strains.

表2 各菌株淀粉酶抑制活性測(cè)定 Table 2 The inhibitory effects of the strains on amylase.

2.3 蛋白酶抑制活性

在對(duì)菌株代謝產(chǎn)物進(jìn)行淀粉酶抑制活性測(cè)定的同時(shí)進(jìn)行蛋白酶抑制活性的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表3）顯示，F(xiàn)IMe-3 對(duì)蛋白酶無抑制活性；FIM-1013、FIL-19和FIFr-89菌株對(duì)蛋白酶有微弱的活性抑制；FIM-121、FIN-97和 FITs-221菌株對(duì)蛋白酶活性抑制能力較強(qiáng)；其他菌株對(duì)蛋白酶也有一定的抑制能力。

表3 各菌株蛋白酶抑制活性的測(cè)定 Table 3 The inhibitory effects of the strains on protease.

2.4 胰脂肪酶抑制活性

對(duì)來源于土壤的微生物通過胰脂肪酶抑制劑篩選模型進(jìn)行篩選，得到11株胰脂肪酶抑制劑產(chǎn)生菌，其中三株放線菌FIM-1013、FIL-19 和FIMe-3具有較強(qiáng)的胰脂肪酶抑制活性，而對(duì)淀粉酶、蛋白酶活性無顯著抑制活性，符合胰脂肪酶抑制劑減肥藥物開發(fā)的需求。對(duì)此三株菌株進(jìn)行胰脂肪酶抑制活性的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表4）顯示，F(xiàn)IM-1013、FIL-19和FIMe-3菌株對(duì)胰脂肪酶的抑制活性無顯著差異，其中FIM-1013菌株對(duì)胰脂肪酶的抑制活性最強(qiáng)。

表4 各菌株胰脂肪酶抑制活性的測(cè)定 Table 4 The inhibitory effects of the strains on pancrelipase.

3 討論

本研究根據(jù)姚朗等的方法建立胰脂肪酶抑制劑體外篩選模型，該模型靈敏可靠、實(shí)用性強(qiáng)。應(yīng)用此模型對(duì)來源于土壤的微生物進(jìn)行篩選，再結(jié)合對(duì)菌株淀粉酶、脂肪酶抑制活性的分析，得到三株胰脂肪酶抑制劑產(chǎn)生菌FIM-1013、FIL-19和FIMe-3，具有較強(qiáng)的胰脂肪酶抑制活性，而對(duì)淀粉酶、蛋白酶活性無顯著抑制能力，其高度選擇性與賽尼可相似，具有潛在的應(yīng)用開發(fā)前景，值得更深入地研究。研究將進(jìn)一步對(duì)三個(gè)菌株進(jìn)行發(fā)酵工藝的優(yōu)化，提高菌株產(chǎn)胰脂肪酶抑制劑的能力，并嘗試從菌株發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化得到胰脂肪酶抑制劑純品，研究其理化特性并通過有機(jī)波譜方法對(duì)獲得的胰脂肪酶抑制劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，比較本研究獲得的胰脂肪酶抑制劑與已知胰脂肪酶抑制劑的生物活性和結(jié)構(gòu)，以期得到新的強(qiáng)效胰脂肪酶抑制劑。

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