高效液相色譜法測定大麥蟲磷脂酰膽堿含量

范志影， 石冬冬， 常碧影， 張 萍

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100080

大麥蟲（Zophobsmorio L.）屬于節(jié)肢動(dòng)物門、昆蟲綱、鞘翅目、擬步甲蟲科昆蟲，俗稱麥片蟲、麥谷蟲或超級面包蟲［1］，是國內(nèi)剛開始試驗(yàn)養(yǎng)殖的新型資源昆蟲。大麥蟲具有繁殖速度快、食物轉(zhuǎn)化率高的特點(diǎn)，是尚未充分開發(fā)的可再生性生物資源［2］。近年來，利用昆蟲生產(chǎn)功能性食品、醫(yī)藥品已經(jīng)形成一定的科研基礎(chǔ)，但對蛋白質(zhì)類，如抗菌肽、昆蟲抗凍蛋白等［3］為主體功能性成分的產(chǎn)品體系關(guān)注較多，對昆蟲油脂、磷脂等脂質(zhì)類產(chǎn)品的研究相對較少［4，5］。

磷脂酰膽堿（PC）俗稱卵磷脂，是生命的基礎(chǔ)物質(zhì)，人類生命自始至終都離不開它的滋養(yǎng)和保護(hù)。磷脂酰膽堿存在于每個(gè)細(xì)胞之中，更多集中在腦及神經(jīng)系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等重要器官［6］。大量研究表明，磷脂酰膽堿具有提高記憶［7］、增強(qiáng)免疫、保護(hù)肝肺［8～11］、調(diào)節(jié)血脂、防治糖尿病及延緩機(jī)體衰老等多種保健功能［12，13］，被譽(yù)為與蛋白質(zhì)、維生素并列的“第三營養(yǎng)素”［6］。大麥蟲的干基油脂含量高達(dá)48.99%，且富含維生素E和磷脂酰膽堿，無論是在量上還是質(zhì)上都潛藏著巨大的研究、開發(fā)和利用價(jià)值。所以建立一種快速、靈敏、有效的測定大麥蟲中磷脂酰膽堿含量的方法在大麥蟲磷脂酰膽堿產(chǎn)品開發(fā)方面有重要意義。

近年來，對保健品中磷脂酰膽堿的分析研究報(bào)道較多，主要有分光光度法［14～18］、薄層色譜法［19，20］、熒光分光光度法［21］和高效液相色譜法等［22～24］。但關(guān)于大麥蟲中磷脂酰膽堿的測定方法的研究還未見報(bào)道。本文建立了大麥蟲中磷脂酰膽堿含量的高效液相色譜法，可以滿足實(shí)際樣品分析的要求，為開發(fā)大麥蟲功能性油脂產(chǎn)品提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從蟲卵孵出開始以麥麩和白菜（1∶2）為飼料進(jìn)行室內(nèi)養(yǎng)殖，養(yǎng)殖室溫度20～27℃，相對濕度45%～55%，日光燈照明12h。從卵孵出后14d開始取樣，之后每7d取一次樣品，共取出12組樣品（即分別取14日齡、21日齡、28日齡、35日齡、42日齡、49日齡、56日齡、63日齡、70日齡、77日齡、84日齡和91日齡的大麥蟲幼蟲），每組樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取樣量約2g，取出后停食24h后-20℃冷凍待測。

1.2 儀器及主要設(shè)備

Waters e2695型高效液相色譜儀（美國）配有二極管陣列檢測器（PDA）（Waters 2998）和色譜工作站；超純水凈化儀（611XW-80A，Sartorius公司）；超聲萃取儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；0.22μm微孔濾膜（天津津騰科技有限公司）。

1.3 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

磷脂酰膽堿（99%，美國Sigma-Aldrich公司）；甲醇（色譜純）；磷酸（分析純）；1% 磷酸溶液。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，終濃度為25mg／mL。

工作曲線系列溶液：準(zhǔn)確量取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇稀釋，得到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度分別為250、500、1 000、1 500、2 000μg／mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 試液制備 準(zhǔn)確稱取1.000g冷凍大麥蟲幼蟲于50mL離心管中，加入10mL甲醇于離心管中，然后在10 000r／min轉(zhuǎn)速下高速勻漿2 min后，超聲提取10min（超聲萃取儀中需放入適量冰塊，避免水溫升高），于預(yù)冷過的4℃下的冷凍離心機(jī)中以5 000r／min離心10min，取上清液通過0.22μm濾膜后上機(jī)測定。

1.5.2 色譜條件 色譜柱采用zorbox Rx-sil（5μm，150mm×2.1mm i.d）；流速為0.5mL／min；柱溫為30℃；流動(dòng)相為 甲醇∶1% 磷酸溶液（50∶1）等度洗脫；檢測波長為205nm；進(jìn)樣量為20μL；數(shù)據(jù)采集時(shí)間10min。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

通過比較不同色譜柱對目標(biāo)化合物的保留性，以及色譜鋒形狀等參數(shù)，最終確定選擇zorbox Rx-sil（5μm，150mm×2.1mm i.d）色譜柱。流動(dòng)相選擇甲醇∶1% 磷酸溶液（50∶1）等度洗脫，目標(biāo)化合物有較好的峰形，色譜圖如圖1所示。

圖1 500μg／mL磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖 Fig.1 The chromatogram of 500μg／mL phosphatidylcholine standard solution.

2.2 儀器方法的精密度實(shí)驗(yàn)

選擇質(zhì)量濃度500μg／mL標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣7針，計(jì)算保留時(shí)間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，磷脂酰膽堿保留時(shí)間為2.983min，變異小于0.1%，峰面積的變異小于1.5%，說明本方法所選擇的儀器條件有較好的測量精密度。

2.3 工作曲線的測定

工作曲線系列溶液按照選定的色譜條件上機(jī)，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y＝2.784e＋5＋1.148e＋4，相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 6。結(jié)果表明，在250～2 000 μg／mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性相關(guān)（圖2）。

圖2 磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 Fig.2 The standard curve of phosphatidylcholine.

2.4 方法的回收率及精密度試驗(yàn)

選用已知磷脂酰膽堿含量的大麥蟲樣品，分別以1.0g／kg、4.0g／kg和8.0g／kg質(zhì)量濃度梯度加入磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品，每梯度做3個(gè)重復(fù)，以外標(biāo)法定量，測定加標(biāo)回收率及方法的重復(fù)性（見表1），色譜圖如圖3所示。結(jié)果表明，加標(biāo)回收率在97%～109%之間、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.4%，說明此方法的回收效率和精密度可以滿足實(shí)際樣品的檢測需求。

2.5 不同生長階段大麥蟲磷脂酰膽堿含量比較

選擇幼蟲至成蟲不同生長階段的大麥蟲，分成12組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。1組日齡最短，個(gè)體重量最小，12組日齡最長，個(gè)體重量最大。分別測定12組大麥蟲磷脂酰膽堿含量，結(jié)果見圖4。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝3） Table 1 The results of the recovery experiment（n＝3）.

圖3 大麥蟲樣品磷脂酰膽堿色譜圖 Fig.3 The chromatogram of phosphatidylcholine in Zophobsmorio L.

圖4 大麥蟲體重與其體內(nèi)磷脂酰膽堿含量的關(guān)系 Fig.4 The correlation between weight and the phosphatidylcholine levels of Zophobsmorio L.

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，不同個(gè)體重量的大麥蟲體內(nèi)磷脂酰膽堿含量在8.65～14.80g／kg之間，在大麥蟲幼蟲生長的前期和中期，隨著日齡的增長、體重的增加，大麥蟲體內(nèi)磷脂酰含量呈降低的趨勢，在達(dá)到0.64g時(shí)磷脂酰膽堿含量最低（8.65g／kg），但在大麥蟲幼蟲生長的后期，其體內(nèi)磷脂酰膽堿的含量略有回升。

利用SPSS軟件對體重與磷脂酰膽堿含量間的關(guān)系進(jìn)行回歸分析結(jié)果顯示，體重與磷脂酰膽堿含量間呈顯著相關(guān)，其變化規(guī)律符合二項(xiàng)式曲線，相關(guān)系數(shù)R2＝0.865，P＜0.01，結(jié)果如表2所示。

表2 體重與磷脂酰膽堿含量間的關(guān)系回歸分析 Table 2 The regression analysis of the relationship between weight and the content of phosphatidylcholine.

3 討論

大麥蟲是一種新型資源昆蟲，其體內(nèi)富含多種功能性成分，日益受到食品、飼料以及醫(yī)藥加工領(lǐng)域的關(guān)注。磷脂酰膽堿是大麥蟲體內(nèi)一個(gè)功能性活性成分，其檢測方法的研究和含量的測定，對大麥蟲資源的功能開發(fā)是非常必要的。本研究采用高效液相色譜法測定大麥蟲體內(nèi)磷脂酰膽堿的含量。研究中對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，其線性范圍、線性相關(guān)等參數(shù)可滿足生大麥蟲體內(nèi)磷脂酰膽堿含量的檢測需求，方法的回收率和精密度好，前處理方法簡單易行。

本研究采用所建立的方法對不同生長階段大麥蟲體內(nèi)磷脂酰膽堿含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，大麥蟲體內(nèi)磷脂酰膽堿含量隨個(gè)體重量的變化符合二項(xiàng)式曲線的變化規(guī)律，相關(guān)系數(shù)R2＝0.865（P＜0.01），在體重為0.02g時(shí)有最高值14.80g／kg，在體重達(dá)到0.64g時(shí)磷脂酰膽堿含量最低為8.65g／kg，但在大麥蟲幼蟲生長的后期略有回升，在體重為0.82g時(shí)磷脂酰膽堿含量為9.51g／kg，此時(shí)將大麥蟲幼蟲加工成產(chǎn)品，可以使產(chǎn)品具有較高的磷脂酰膽堿含量。另外，磷脂酰膽堿是重要的生命基礎(chǔ)物質(zhì)之一，監(jiān)測磷脂酰膽堿在體內(nèi)含量的變化對于指示大麥蟲的生長發(fā)育狀況也有著重要意義。

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