高效液相色譜法測(cè)定斑蝥素鈉維生素B6注射液中維生素B6的含量

江蘇省泰州市食品藥品檢驗(yàn)所 （225300） 顧秋琴

斑蝥酸鈉維生素B6注射液（Disodium Cantharidinate and Vitamin B6Injection）為復(fù)方制劑，其組分為：斑蝥酸鈉和維生素B6，適用于原發(fā)性肝癌、肺癌及白細(xì)胞低下癥。維生素B6參與氨基酸和脂肪的代謝，刺激白細(xì)胞生成。該制劑中維生素B6的含量測(cè)定現(xiàn)行國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-10001-(HD-0046)-2002采用吸收系數(shù)法，方法易受影響因素干擾，專屬性不高。本文建立了操作簡(jiǎn)便，專屬性更強(qiáng)的HPLC法測(cè)定維生素B6的含量，結(jié)果準(zhǔn)確。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國(guó)Waters 2695型高效液相色譜儀（檢測(cè)器：Waters2996二極管陣列），waters symmetry C18色譜柱（150mm×4.6mm,5μm）；日本島津UV-2550型紫外分光光度計(jì)。

1.2 試藥 斑蝥酸鈉維生素B6注射液（貴州某制藥股份有限公司，規(guī)格：10ml，批號(hào)：2012090901，2012100403，2013040201）；斑蝥酸鈉（廠家提供）；戊烷磺酸鈉、冰醋酸均為分析純，水為超純水，甲醇為色譜純。

1.3 對(duì)照品 維生素B6對(duì)照品（中檢院，批號(hào)10116-201103，含量：100.0%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品維生素B650mg，置50ml容量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液5ml，置100ml容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取供試品10ml（約相當(dāng)于維生素B62.5mg），置50ml容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 空白溶液的制備 按處方比例，取斑蝥酸鈉適量加注射用水制成空白供試品，再精密量取空白供試品10ml，置50ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

附圖 高效液相色譜圖

附表 1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

附表 2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（標(biāo)示量/%）

2.2 色譜條件與專屬性考察 以0.04%戊烷磺酸鈉（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）-甲醇（88∶12）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為291nm；流速約為1.0mL·min-1；柱溫為35℃；進(jìn)樣量10μL。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果空白溶液無干擾，理論板數(shù)按維生素B6計(jì)算約為4500，見附圖。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 分別精密量取維生素B6對(duì)照品儲(chǔ)備液1ml、2ml、3ml、4 ml、5ml置25ml容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。照“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，結(jié)果在39.33～196.6 mg·L-1范圍內(nèi)，回歸方程A=23169C+8178（r＝1.000），色譜峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度與重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取濃度為49.16mg·L-1的對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積的RSD為0.25%(n＝5),表明本方法的精密度良好；取供試品（批號(hào)：2012090901），平行制備5份供試品溶液，分別測(cè)定維生素B6的含量，平均為99.74%， RSD為0.21%（n＝5），表明本方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別于0、6、12、18、24h進(jìn)樣，記錄維生素B6的峰面積， 計(jì)算RSD為0.32%，表明維生素B6在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 檢測(cè)限和定量限 取對(duì)照品溶液，經(jīng)過一系列稀釋，進(jìn)樣測(cè)定，以基線噪音的3倍計(jì)算，維生素B6的最低檢測(cè)濃度為0.079 mg·L-1；以基線噪音的10倍計(jì)算，維生素B6的最低定量濃度為0.296 mg·L-1。

2.7 回收率試驗(yàn) 分別精密量取9份已測(cè)知含量的供試品（批號(hào)：2012090901）10ml置50ml容量瓶中，再分別精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液2 ml、2 ml、2 ml、2.5 ml、2.5 ml、2.5 ml、3ml、3 ml、3ml，加流動(dòng)相稀釋至刻度，按樣品含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見附表1。

2.8 樣品含量測(cè)定 取對(duì)照品溶液與供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算含量，并與紫外-可見分光光度法測(cè)定結(jié)果作比較（附表2）。

3 討論

參照《中國(guó)藥典》2010年版二部正文維生素B6原料的含量測(cè)定，適當(dāng)調(diào)整有機(jī)相和水相的比例，采用0.04%戊烷磺酸鈉 （用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）-甲醇（88∶12）為流動(dòng)相，斑蝥酸鈉維生素B6注射液樣品的出峰時(shí)間適宜，峰形好，理論板數(shù)高。

采用二極管陣列檢測(cè)器分別對(duì)供試品溶液和對(duì)照品溶液在200～350nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行3D圖譜掃描，結(jié)果均在291nm有最大吸收，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為291nm。

由附表2可見，兩種方法測(cè)定三批樣品的結(jié)果基本一致，但吸收系數(shù)法因方法本身的專屬性不高，易受測(cè)定環(huán)境、儀器性能及樣品中含有在291nm波長(zhǎng)處有紫外吸收的其他物質(zhì)的干擾。而高效液相法的專屬性強(qiáng)，更適用于測(cè)定斑蝥酸鈉維生素B6注射液中維生素B6的含量。