HPLC測定止咳祛痰靈中甘草酸、甘草苷的含量

江蘇省泰州市中醫(yī)院（225300）徐蓉

附圖 止咳祛痰靈HPLC色譜圖

止咳祛痰靈是我市中醫(yī)院研制開發(fā)的中藥制劑，主要由射干、紫苑、桔梗、甘草等多味中藥組成，具有止咳、祛痰之功效，用于咳嗽、急慢性支氣管炎等癥狀。其中甘草味甘、性平。具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥之功能[1]，為有效控制其內(nèi)在質(zhì)量，筆者參考有關(guān)文獻(xiàn)[1]，建立了高效液相色譜法（HPLC法）測定止咳祛痰靈中甘草酸、甘草苷含量的方法。本法操作簡便，甘草酸、甘草苷峰與其他組分峰分離良好，結(jié)果準(zhǔn)確。

1 儀器與試藥

1.1 儀器高效液相色譜儀：Waters2695/2996/Empower色譜系統(tǒng)。

1.2 試藥 甘草酸銨、甘草苷對(duì)照品（供含量測定用，由中國藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)為110731-200615、111610-200402）；止咳祛痰靈（泰州市中醫(yī)院提供，20mL/支，批號(hào)：120326、120410、120606）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Waters XBridge C18柱（4.6mm×150mm，3.5μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按附表1進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為237nm；流速1.0ml/min；柱溫：35℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取用五氧化二磷干燥至恒重的甘草酸銨、甘草苷對(duì)照品適量，加甲醇制成0.0579mg/ml、0.0750mg/ml的溶液，備用。（甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207）

2.2.2 樣品溶液 精密量取樣品1ml，置10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液：按處方量制備不含甘草藥材的陰性樣品，按樣品溶液制備方法。制備陰性對(duì)照溶液。以上溶液各進(jìn)樣10μl，記錄色譜圖（附見圖）。

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液配置成甘草酸濃度分別為0.0116、0.0232、0.0347、0.0463、0.0579mg/ml，甘草苷濃度分別為0.0150、0.0300、0.0450、0.0600、0.0750mg/ml的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10μl，記錄峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，甘草酸回歸方程為y=4450139x+29896，r=0.9999，甘草苷回歸方程為y=4398177x+42094，r=0.9997，結(jié)果表明甘草酸對(duì)照品濃度在0.0116～0.0579mg/ml、甘草苷對(duì)照品濃度在0.0150～0.0750mg/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

附表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

附表2 甘草酸加樣回收率

附表3 甘草苷加樣回收率

附表4 樣品含量測定結(jié)果（n=3）

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為甘草酸濃度為0.0597mg/ml、甘草苷濃度為0.0750mg/ml的對(duì)照品溶液10μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄甘草酸、甘草苷峰面積。甘草酸峰面積RSD為1.2%。甘草苷分面積RSD為1.0%。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)120326樣品6份，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述高效液相色譜條件測定。結(jié)果甘草酸含量的RSD為1.1%，甘草苷含量的RSD為1.0%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10μL，按上述色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、24h各進(jìn)樣1次，進(jìn)行測定，RSD為1.0%。結(jié)果表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取批號(hào)120326樣品（甘草酸含量為0.0913mg/ml，甘草苷含量為0.3707mg/ml）5份，精密量取1ml置10ml量瓶中，分別精密加入含甘草酸對(duì)照品0.0597mg/ml溶液2ml，0.0750mg/mL甘草苷對(duì)照品溶液5mL。照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試溶液，按上述高效液相色譜條件測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見附表2、附表3。

2.8 樣品含量測定 精密吸取不同批號(hào)的樣品，按樣品溶液制備方法制備，在上述色譜條件下，進(jìn)行含量測定（見附表4）。

3 討論

3.1 甘草為止咳祛痰靈中的使藥，甘草酸、甘草苷為其主要活性成分之一。為提高藥品質(zhì)量，確保療效，筆者增加了含量測定方法，采用HPLC法對(duì)主要成分甘草酸、甘草苷進(jìn)行定量。

3.2 關(guān)于甘草酸、甘草苷的HPLC法有很多文獻(xiàn)報(bào)道[2][3]，筆者也對(duì)樣品中甘草次酸含量進(jìn)行了考察，但含量很低。流動(dòng)相采用了《中國藥典》2010年版一部甘草項(xiàng)下含量測定方法，對(duì)梯度洗脫進(jìn)行了優(yōu)化，并增加了平衡時(shí)間，結(jié)果色譜圖中對(duì)照品與樣品峰形好，分離度好，陰性對(duì)照無干擾，故采用此梯度洗脫方法。

3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， HPLC法測定止咳祛痰靈中甘草酸、甘草苷的含量，樣品預(yù)處理簡單，陰性對(duì)照無干擾，靈敏度高，準(zhǔn)確性好，可作為止咳祛痰靈質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的參考。