一測多評法同時測定板藍根中4種核苷及(R，S)-告依春

徐小飛，潘雪峰，張慧曄，鄧喬華，黃亦南，王德勤

(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東廣州 510515)

(Hutchison Whampoa Guangzhou Baiyunshan Chinese Medicine Company Limited，Guangzhou 510515，China)

中藥成分較為復雜，逐步建立采用多指標成分綜合評價中藥質量的新模式，更能表征中藥化學成分的整體性和復雜性，從而有效地評價中藥的質量［1-4］。在中藥多指標質量評價過程中，一測多評［5］(quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS)法由于易于實現(xiàn)多成分的同步測定，在中藥大品種的原料、成品生產和檢驗中備受企業(yè)的青睞，其顯著的優(yōu)勢在于采用相對校正因子，能夠在僅使用一個對照品的情況下，實現(xiàn)多指標成分測定，成為一種適合中藥特點的多指標質量評價新模式。并已成功運用于人參、三七、關黃柏等藥材中多種成分的定量測定［6-8］。

板藍根Isatidis Radix來源于十字花科植物菘藍Isatis indigotica Fort.的干燥根。具有清熱、解毒、涼血、利咽之功效，是清熱解毒類中藥的代表藥物。 《中國藥典》2010年版中板藍根僅僅使用(R，S)-告依春單一檢測指標［9］，不能全面反映板藍根藥材的質量。現(xiàn)代藥理研究表明板藍根中核苷類成分具有抗毒、解熱和活血等作用［10-12］。所以，本實驗以相對較穩(wěn)定且對照品易得的腺苷、胞苷和尿苷為對照，考察建立“一測多評”分析方法測定板藍根中主要活性成分胞苷、腺苷、尿苷、鳥苷和 (R，S)-告依春的量的可行性，為板藍根藥材質量標準的提高及“一測多評”法在中藥質控中的推廣應用提供了更充分的實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀 (美國Agilent公司)、Agilent 1100高效液相色譜儀 (美國Agilent公司)和Waters 2695-2996高效液相色譜儀 (美國Waters公司)。CP225D十萬分之一電子天平 (Sartorius公司)、BT214D萬分之一電子天平 (Sartorius公司)、SB25-12DTD超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)及錐形瓶、漏斗、濾紙等。

1.2 試劑 甲醇 (色譜純，美國Tedia公司)，水為高純水，其余試劑均為分析純。

1.3 對照品及樣品 腺苷 (批號110879-201202)對照品購自中國藥品生物制品鑒定所，鳥苷 (批號106K1848)、尿苷 (批號 1001157075)、胞苷(批號100914316)對照品購自德國SIGMA公司，(R，S)-告依春 (批號111753-201103)對照品購自中國食品藥品檢定研究院。實驗用33批板藍根藥材收集于黑龍江大慶、安徽、河南、河北、陜西、山西、山東日照和甘肅，經廣東省中藥研究所丘金裕教授鑒定，原植物為十字花科植物菘藍Isatis indigotica Fort.的干燥根。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為水-甲醇，梯度洗脫(0～20 min，5% ～5%甲醇;20～30 min，5% ～15%甲醇;30～45 min，15% ～15%甲醇)。體積流量0.5 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫30℃，進樣量10 μL。色譜峰記錄時間為45 min，隨后繼續(xù)運行20 min。上述色譜條件下，各待測組分峰分離效果良好 (分離度＞1.5)，見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備 取胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷、(R，S)-告依春各對照品適量，精密稱定，置棕色瓶中，加水制成每1 mL含胞苷0.0212 mg、尿苷0.0382 mg、鳥苷 0.0380 mg、腺苷0.0282 mg、(R，S)-告依春0.2881 mg的混合溶液，搖勻，即得。

圖1 對照品和板藍根樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and sample of Isatidis Radix

2.1.3 供試品溶液的制備 取板藍根粉末 (過四號篩)約1 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入水50 mL，稱定質量，搖勻，超聲30 min，放冷，再稱定質量，用水補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關系考察 分別吸取“2.1.2”項下對照品溶液分別進樣1、2、4、6、8、10 μL，以混合對照品溶液中各成分進樣體積與峰面積積分值進行線性回歸處理，得到胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷和(R，S)-告依春的標準曲線。結果表明5種成分在相應的線性范圍內線性關系良好，結果見下表1。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear regression equations of each component

2.1.5 精密度考察 精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，結果胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷和 (R，S)-告依春的RSD分別為0.1%、0.2%、0.2%、0.2%、0.8%。表明儀器的精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 取新制備的板藍根供試品溶液，在室溫下放置 0、2、4、8、10、12 h后各精密吸取10 μL進樣，胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷和(R，S)-告依春色譜峰峰面積的RSD分別為2.0%、1.1%、1.1%、0.5%和1.2%，結果表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復性考察 取同一批板藍根藥材粉末 (大慶23)，共6份，精密稱定，按“2.1.3”項方法制備樣品，注入高效液相色譜儀進行測定，計算各成分的量，計算得出胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷和(R，S)-告依春的RSD分別為2.2%、1.2%、2.8%、0.7%、2.5%，結果表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率 精密稱取已知含有量的同一批次樣品6份，加入各成分對照品適量，按照“2.1.3”項下方法制備供試液，0.45 μm微孔濾膜濾過，進樣10 μL，按照外標法計算各成分的量，并計算回收率，測定結果見表2。

表2 加樣回收率考察結果 (n=6)Tab.2 Results of recorery tests(n=6)

2.2 相對校正因子的計算及其耐用性驗證

2.2.1 待測成分相對校正因子的計算 在一定的范圍內 (線性范圍內)待測成分的量 (W)與檢測器響應值 (A)成正比，即W=fA，選取待測成分中一組分k為內標，建立組分k與其他組分m之間的相對校正因子，即 fkm=fk/fm= (Wk×Am)/(Wm×Ak)。配置一定質量濃度的混合對照品溶液，精密吸取不同體積的同一混合對照品進樣分析，分別計算不同進樣體積下的fkm，然后計算平均值，并以其作為相對校正因子進行樣品測定，見下表3。

表3 待測成分相對校正因子計算結果 (以腺苷為參照成分)Tab.3 Results of relative correction factors of components under test(adenosine as reference)

2.2.2 采用不同高效液相色譜儀測定的耐用性驗證 取“2.1.2”項下的系列混合對照品溶液，分別精密吸取10 μL，采用Agilent C18色譜柱，分別在Agilent 1260、Agilent 1100、Waters2695-2996高效液相色譜儀上進樣檢測，求算以胞苷、尿苷及腺苷分別作為參照成分時其他4種成分的相對校正因子，結果說明相對校正因子在使用不同儀器時的耐用性良好，結果見表4。

2.2.3 采用不同C18色譜柱測定的耐用性驗證 取“2.1.2”項下的系列混合對照品溶液，分別精密吸取10 μL，在Agilent 1260高效液相色譜儀上，分別采用Agilent C18色譜柱、Dikma Diamonsil C18色譜柱和Hibar RP-18色譜柱進行檢測，求算以胞苷、尿苷及腺苷分別作為參照成分時其他4種成分的相對校正因子，使用不同色譜柱測定時各相對校正因子RSD＜1.25%，說明相對校正因子在使用不同色譜柱時耐用性良好，結果見表5。

2.3 待測成分色譜峰的定位 本研究比較了在使用不同儀器及色譜柱進行測定時，保留時間、保留時間差值 (絕對值)及相對保留時間對5種待測成分色譜峰在色譜圖上的定位準確度 (以RSD值評價)。各待測成分的保留時間、保留時間差值及相對保留值的RSD值分別為0.21%～1.23%;0.62% ～2.41%;0.20% ～1.27%。由結果可知，保留時間差值的變化范圍稍大，保留時間和相對保留時間數(shù)值穩(wěn)定，可以用于待測成分色譜峰的定位，結果見表6、7。

表4 不同液相色譜儀測定的相對校正因子耐用性考察結果Tab.4 Relative correction factors determined with different HPLC instruments

表5 不同C18色譜柱測定的相對校正因子耐用性考察結果Tab.5 Relative correction factors determined on different HPLC columns

表6 板藍根各成分保留時間結果Tab.6 Resulets of the retention time

表7 板藍根各成分保留時間差值絕對值和相對保留時間結果Tab.7 Results of differences in retention time and relative retention values

2.4 “一測多評”法與外標法測定結果的比較以腺苷為代表作為“一測多評”的參照成分，計算33批板藍根藥材樣品中5種成分的質量分數(shù)(Wf)，并與外標法的測定結果 (Ws)進行比較，結果見表8，由表8可見同一成分分別用2種方法求得的含有量值之間均無顯著性差異。此外，采用外標法與“一測多評”法所得數(shù)據(jù)的比值 (Ws/Wf)評價“一測多評”法的準確度，以腺苷作為參照成分時，各成分 (Ws/Wf)的比值在97.48%～104.66%之間。結果表明建立的“一測多評”法的準確度與外標法相當，見表9。

表8 兩種方法測定33批板藍根藥材中5種成分的結果Tab.8 Contents of five kinds of Isatidis Radix by QAMS method and standards calibration method

表9 外標法和一測多評法測定5種成分的準確度比較()Tab.9 Comparision of QAMS method and standards calibration method()

表9 外標法和一測多評法測定5種成分的準確度比較()Tab.9 Comparision of QAMS method and standards calibration method()

注:準確度=(Ws/Wf)×100%;Ws為外標法;Wf為一測多評法。表中數(shù)據(jù)為33批板藍根藥材的x ± s。

成分 RSD/%胞苷101.57±1.01 0.99101.07±3.59 3.55尿苷 100.23±0.76 0.76鳥苷 100.98±0.74 0.73(R，S)-告依春 99.65 ±0.79 0.79總量

3 討論

3.1 本實驗建立了板藍根中5種有效成分同時測定的“一測多評”方法;在本實驗中所采用的液相色譜條件可同時檢測到板藍根中的胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷、腺嘌呤和(R，S)-告依春6種成分，實驗以外標法的測定結果為標準，以外標法 (Ws)與“一測多評”法 (Wf)分別測得的量的比值(Ws/Wf)評價“一測多評”法計算結果的準確性，結果表明除了腺嘌呤外，其他4種核苷及(R，S)-告依春的量與外標法的測定結果無顯著性差異。

3.2 板藍根中的核苷類成分對照品較難得到，只有腺苷購自國家認可的對照品檢定所，另外通過前期研究發(fā)現(xiàn)，鳥苷、 (R，S)-告依春穩(wěn)定性較差。綜合以上兩點，實驗選擇了對照品易得且較穩(wěn)定的腺苷、尿苷和胞苷為參照成分計算校正因子，論文中僅以腺苷為代表進行驗證。

3.3 本實驗對不同儀器、不同品牌的C18色譜柱及不同波長的相對校正因子的變化進行了研究，結果顯示不同儀器和不同C18色譜柱對相對校正因子的影響較小，RSD值均＜3%，說明本方法對于不同儀器和C18色譜柱具有良好的適用性;而在249～259 nm的5個檢測波長下RSD值較大，說明本方法得到的相對校正因子受檢測波長變化影響較大，因此，在運用本實驗建立的“一測多評”法測定時波長為254 nm，不宜較大波動。

3.4 本實驗分別采用保留時間、保留時間差值(絕對值)和相對保留時間對待測成分色譜峰進行定位，結果顯示除保留時間差值定位準確度稍差外，保留時間和相對保留時間都可以對待測組分峰準確定位。所以在缺乏對照品時，采用本實驗提供的相對校正因子及定位方法，選用另外1種成分作為參照時也可得到較好的定位、定量效果。

3.5 由于對照品純度問題，C18色譜柱填料的性能，不同牌號色譜柱可能有微小差別 (鍵合相的復蓋度、碳含量等)等等均可能帶來較大的誤差，所以此方法也存在一定的局限性。

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