抗糖尿病疫苗肽IA－2－P2對動(dòng)脈粥樣硬化的影響

吳 潔，黃東成，申麗麗，翟婷婷，龍 軍，金 亮（.中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微基因?qū)嶒?yàn)室，南京0009；.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 003）

在科技高速發(fā)展的今天，心血管疾病仍是世界性的最主要致死疾病，全球每年約有1 670萬人死于心血管疾病。心血管疾病的主要病理機(jī)制是動(dòng)脈粥樣硬化（AS），關(guān)于AS的發(fā)病機(jī)制曾有多種學(xué)說，目前普遍認(rèn)為AS是一種慢性炎癥疾病［1］。在AS過程中免疫反應(yīng)貫穿始終，各種抗原、免疫細(xì)胞啟動(dòng)血管壁的免疫反應(yīng)，最終誘發(fā)AS病變形成［2］，其中熱休克蛋白（hsp）及氧化低密度脂蛋白（oxLDL）被認(rèn)為是AS中主要的自體抗原［3－4］。AS斑塊中包含了巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、其他免疫細(xì)胞及膽固醇等。AS斑塊不斷積累壯大，斑塊破裂時(shí)內(nèi)容物暴露，繼而血小板聚集，體液凝固從而引發(fā)血栓，形成多種心血管疾病，常見的如冠心病、高血壓、心率失常等。

IA－2－P2是我們基于人熱休克蛋白（hsp）60與胰島素瘤相關(guān)蛋白2（IA－2）開發(fā)的一種抗1型糖尿?。═1D）疫苗肽?；谌薶sp60一段特異性片段P277開發(fā)的一種抗糖尿病疫苗肽DiaPeP277目前已進(jìn)入Ⅲ期臨床，我們課題組前期研究證實(shí)，P277的后半段P2段為免疫預(yù)防T1D的關(guān)鍵表位［5］。另外IA－2為T1D中的一種自體胰島抗原，近年有報(bào)道發(fā)現(xiàn)IA－2的免疫療法對T1D有預(yù)防作用［6］。據(jù)此，我們用IA－2的兩段B表位替換P277原來的前半段，構(gòu)成新的抗T1D疫苗肽IA－2－P2，已證明該肽對NOD小鼠有預(yù)防T1D的作用。

HSP65／60分子屬于HSP60家族，相對分子質(zhì)量在60kDa左右，是生物體對外界刺激發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生的應(yīng)激蛋白，進(jìn)化上高度保守。自1992年起，人們已發(fā)現(xiàn)hsp60／65與 AS的高度相關(guān)性［7］；近年來許多研究表明，通過皮下免疫h(yuǎn)sp60／65可促進(jìn)AS的進(jìn)程［8－9］，但也有研究發(fā)現(xiàn)，如果通過黏膜免疫h(yuǎn)sp60／65會(huì)造成免疫耐受進(jìn)而減輕模型動(dòng)物AS程度［10－12］。我們課題組前期研究P277與AS的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，在高脂飼料喂養(yǎng)下以P277與弗氏不完全佐劑乳化后免疫可增加實(shí)驗(yàn)兔AS斑塊面積，提示P277對AS可能存在的促進(jìn)作用。因IA－2－P2的P2肽段來源于P277，本研究旨在考察在高脂飼料喂養(yǎng)下IA－2－P2與AS的關(guān)系。

1 儀器與材料

1.1 儀器 生化自動(dòng)分析儀：Beckman Coulter Synchron DXC800。

1.2 材料 IA－2－P2多肽，氨基酸序列為“HGDTTFEYQDIPALDSLTPANED”，由上海吉爾公司通過自動(dòng)化多肽合成儀合成，HPLC檢測質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞90%；10mmol·L－1鹽緩沖液（PBS）：8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，加 水 至1 000mL；弗氏不完全佐劑（IFA）：購自Sigma公司。

1.3 動(dòng)物 20只雄性新西蘭大白兔，實(shí)驗(yàn)前平均體質(zhì)量約為2kg，購自江蘇省農(nóng)科院種兔場。隨機(jī)分為3組：低脂PBS組6只（PBS組），高脂PBS組6只（HCD 組），高 脂IA－2－P2組 8 只 （HCD＋I(xiàn)A－2－P2組）。保證飲水充足，低脂組以普通飼料喂養(yǎng)，高脂組以添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%膽固醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%蛋黃粉的高脂飼料喂養(yǎng)［13］，持續(xù)17周。將PBS或是多肽溶液與IFA乳化，1mL乳化劑含0.5mL蛋白／PBS溶液（1mg·mL－1）和0.5mL IFA，每只兔給藥1mL，背部皮下6點(diǎn)免疫，第0周起免疫，間隔4周，共免疫4次。免疫前禁食12h，每只兔取2mL血液，分離得血清用于血脂檢測。

2 指標(biāo)檢測

2.1 血脂測定 使用生化自動(dòng)分析儀測定血清總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、三酰甘油（TG）。

2.2 主動(dòng)脈斑塊分析 17周處死所有實(shí)驗(yàn)兔，從主動(dòng)脈弓至骼動(dòng)脈處取下主動(dòng)脈，縱向剪開。于福爾馬林中固定2d，以溶于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中的2g·L－1蘇丹Ⅲ溶液染色20min，再以體積分?jǐn)?shù)75%乙醇脫色［2］。拍照片后以MapInfo軟件計(jì)算斑塊百分比。

2.3 數(shù)據(jù)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Student’s test檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，判定P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 體質(zhì)量 第0，4和16周時(shí)各組實(shí)驗(yàn)兔體質(zhì)量基本一致，各組間均無顯著性差異，提示高脂飼料喂養(yǎng)以及IA－2－P2免疫對兔體質(zhì)量都無明顯影響。

3.2 血脂

3.2.1 總膽固醇（TC）如圖1A所示，2個(gè)高脂組中TC值第4周起有顯著變化，均接近10mmol·L－1。至16周時(shí)，PBS組TC基本不變，HCD組TC值在16mmol·L－1左右，HCD＋I(xiàn)A－2－P2組血脂稍高（約達(dá)到19mmol·L－1），但高脂組間TC值無顯著性差異（P＞0.05），高脂組與低脂組間有極顯著性差異（P＜0.01）。

3.2.2 三酰甘油（TG）如圖1B，各組起始TG值基本一致；4周時(shí)各組TG值都稍微下降，但仍都在同一水平；16周低脂組TG仍不變而各高脂組TG均上升到2～3mmol·L－1，但各組間均無顯著性差異（P＞0.05）。可能是由于實(shí)驗(yàn)兔TG值自身波動(dòng)較大，高脂飼料喂養(yǎng)未能造成顯著性提升。

3.2.3 高密度脂蛋白（HDL）如圖1C，各組起始HDL基本一致；4周后低脂PBS對照組HDL無明顯變化，而各高脂組HDL都上升到了1.3mmol·L－1左右；16周低脂PBS對照組HDL仍不變，而各高脂組 HDL都升至2mmol·L－1以上，其中IA－2－P2組HDL稍高（接近3mmol·L－1），但經(jīng)計(jì)算各高脂組間無顯著性差異（P＞0.05），高脂組與低脂組間均有顯著性差異（P＜0.05）。

3.2.4 低密度脂蛋白（LDL）如圖1D，各組起始LDL基本一致；4周后低脂PBS對照組LDL無明顯變化，而各高脂組LDL都上升到了2mmol·L－1左右；16周時(shí)低脂組LDL不變，高脂組LDL達(dá)到4mmol·L－1以上，且高脂IA－2－P2組 LDL較其他高脂組偏高，但經(jīng)計(jì)算各高脂組間LDL均無顯著性差異（P＞0.05），高脂組與低脂PBS組間LDL有顯著性差異（P＜0.05）

圖1 抗糖尿病疫苗肽IA－2－P2對血脂水平的影響A.總膽固醇；B.三酰甘油；C.高密度脂蛋白；D.低密度脂蛋白注：與PBS組相比＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Fig.1 Effects of anti－diabetic peptide vaccine IA－2－P2on blood lipid levelsA.total cholesterol（TC）；B.triglyceride（TG）；C.high density lipoprotein（HDL）；D.low density lipoprotein（LDL）Note：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs the PBS group

3.3 主動(dòng)脈斑塊面積分析 如圖2所示，經(jīng)MapInfo軟件計(jì)算，PBS低脂組基本無斑塊，高脂PBS組斑塊比例約為18%，而高脂IA－2－P2組斑塊比例約為28%，與高脂PBS組相比，P＞0.05，無顯著性差異。顯示在高脂喂養(yǎng)條件下IA－2－P2對AS可能有輕度促進(jìn)作用。

4 討論

本研究首次闡明了在高脂飼料喂養(yǎng)下P277類似肽IA－2－P2免疫對AS模型兔的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IA－2－P2免疫對模型兔的體質(zhì)量增加無明顯影響，提示IA－2－P2對兔的食欲與生長無影響；與高脂對照組相比，IA－2－P2對血脂水平無明顯影響，包括TC、TG、HDL、LDL；而最終斑塊統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)相較于高脂對照組（18%），IA－2－P2形成面積更大的斑塊（28%），但數(shù)據(jù)分析二者P＞0.05。高血脂導(dǎo)致AS斑塊形成，而IA－2－P2的免疫在高脂飲食的情況下對AS斑塊的形成有輕度促進(jìn)作用，但對正常飲食的家兔AS斑塊的形成是否有促進(jìn)作用，相關(guān)實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。我們在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高脂飼料喂養(yǎng)下，P277免疫也可加重實(shí)驗(yàn)兔AS斑塊生成，而在普通飼料喂養(yǎng)下對實(shí)驗(yàn)兔AS斑塊形成卻沒有影響（數(shù)據(jù)正在整理中）。

Hsp60不單是T1D中的自身抗原，研究表明Hsp60／65與多種自身免疫疾病相關(guān)，包括T1D、關(guān)節(jié)炎、多 發(fā) 性 硬 化、動(dòng) 脈 粥 樣 硬 化 等［14－15］。 由 于Hsp60／65較高的同源性，可能發(fā)生交叉免疫反應(yīng)。人體正常情況下存在抗hsp60免疫力，人血管內(nèi)皮細(xì)胞不在胞外表達(dá)hsp60，但在經(jīng)典AS風(fēng)險(xiǎn)因子壓力下，內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)同步表達(dá)黏附分子與hsp60，繼而已有的抗微生物hsp60免疫力會(huì)對目標(biāo)分子殺傷，從而促進(jìn)AS進(jìn)程。高脂飲食作為經(jīng)典AS風(fēng)險(xiǎn)因子之一，可引起內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)hsp60，導(dǎo)致機(jī)體本身對hsp60分子的細(xì)胞、體液免疫產(chǎn)生應(yīng)答，損毀靶細(xì)胞，引起單核細(xì)胞內(nèi)膜浸潤，從而促進(jìn)炎癥發(fā)生［16］。

Perschinka等報(bào)道，認(rèn)為hsp60上位于437～452肽段的B表位與hsp65相應(yīng)表位存在交叉免疫［17］，Uray等的結(jié)果也與之相符［18］。IA－2－P2包含hsp60的部分B表位（448～452），并含有與自身免疫糖尿病相關(guān)的關(guān)鍵T表位，免疫后可引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫。以佐劑混合后免疫IA－2－P2，同時(shí)激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，可能造成機(jī)體上調(diào)對hsp60的免疫力，對目標(biāo)內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的hsp60分子進(jìn)行免疫，從而加劇斑塊處炎癥，繼而促進(jìn)AS斑塊產(chǎn)生，但由我們所獲數(shù)據(jù)顯示這一促進(jìn)作用是十分有限的。

本研究表明，在高脂飼料喂養(yǎng)條件下，與模型組相比免疫IA－2－P2后，實(shí)驗(yàn)兔體質(zhì)量及血脂水平無明顯改變，但在一定程度上會(huì)促進(jìn)AS斑塊的形成，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

［1］Hansson G K，Hermansson A.The immune system in atherosclerosis ［J］.Nat Immunol，2011，12（3）：204－212.

［2］楊永宗.動(dòng)脈粥樣硬化性心血管病基礎(chǔ)與臨床 ［M］.北京：科學(xué)出版社，2004：50－51.

［3］Blasi C.The autoimmune origin of atherosclerosis［J］.Atherosclerosis，2008，201（1）：17－32.

［4］張明發(fā)，沈雅琴.甘草抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗血栓形成研究進(jìn)展 ［J］.西北藥學(xué)雜志，2011，26（3）：222－226.

［5］Ma Y J，Lu Y，Hou J，et al.Vaccination of non－obese diabetic mice with a fragment of peptide P277attenuates insulin－dependent diabetes mellitus［J］.Int Immunopharmacol，2011，11（9）：1298－1302.

［6］Guan Y，Zhang M，Li Y，et al.Vaccination with IA－2 autoantigen can prevent late prediabetic nonobese diabetic mice from developing diabetes mellitus［J］.Diabetes Res Clin Pract，2012，95（1）：93－97.

［7］Xu Q，Dietrich H，Steiner H J，et al.Induction of arteriosclerosis in normocholesterolemic rabbits by immunization with heat shock protein 65 ［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1992，12（7）：789－799.

［8］Afek A，George J，Gilburd B，et al.Immunization of low－density lipoprotein receptor deficient （LDL－RD）mice with heat shock protein 65 （HSP－65）promotes early atherosclerosis［J］.J Autoimmun，2000，14（2）：115－121.

［9］George J，Shoenfeld Y，Afek A，et al.Enhanced fatty streak formation in C57BL／6Jmice by immunization with heat shock protein－65 ［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1999，19（3）：505－510.

［10］Harats D，Yacov N，Gilburd B，et al.Oral tolerance with heat shock protein 65attenuates Mycobacterium tuberculosis－induced and high－fat－diet－driven atherosclerotic lesions［J］.J Am Coll Cardiol，2002，40（7）：1333－1338.

［11］van Puijvelde G H M，van Es T，van Wanrooij E J A，et al.Induction of oral tolerance to HSP60or an HSP60－peptide activates T cell regulation and reduces atherosclerosis［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27（12）：2677－2683.

［12］Maron R，Sukhova G，F(xiàn)aria A M，et al.Mucosal administration of heat shock protein－65decreases atherosclerosis and inflammation in aortic arch of low－density lipoprotein receptor－deficient mice ［J］.Circulation，2002，106（13）：1708－1715.

［13］張均田.現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法［M］.北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1998：1259－1260.

［14］Quintana F J，Cohen I R.The HSP60immune system network［J］.Trends Immunol，2011，32（2）：89－95.

［15］Wick G，Kleindienst R，Schett G，et al.Role of heat shock protein 65／60in the pathogenesis of atherosclerosis［J］.Int Arch Allergy Immunol，1995，107（1－3）：130－131.

［16］Grundtman C，Kreutmayer S B，Almanzar G，et al.Heat shock protein 60and immune inflammatory responses in atherosclerosis ［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011，31（5）：960－968.

［17］Perschinka H，Mayr M，Millonig G，et al.Cross－reactive B－cell epitopes of microbial and human heat shock protein 60／65in atherosclerosis ［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23（6）：1060－1065.

［18］Uray K，Hudecz F，F(xiàn)ust G，et al.Comparative analysis of linear antibody epitopes on human and mycobacterial 60－kDa heat shock proteins using samples of healthy blood donors ［J］.Int Immunol，2003，15（10）：1229－1236.