益髓生血顆粒特定指紋圖譜及特征峰分析

孫玉雯，劉起華，文 謹(jǐn)，吳志奎

(中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

中藥是典型的復(fù)雜體系，具有多組分與多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，在目前對其臨床療效了解較多而作用機(jī)制尚未完全明了的情況下，僅以某一指標(biāo)性成分的定性或定量來評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量是不全面的［1］。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的質(zhì)量控制手段，其基本屬性是整體性和模糊性［2-4］，這與中醫(yī)理論的整體性原則和中藥作用機(jī)制的模糊性是相對應(yīng)的，因此指紋圖譜已成為國際公認(rèn)的控制中藥和天然藥物質(zhì)量的最有效手段［5-6］。

益髓生血顆粒具有滋陰補(bǔ)腎、益髓生血、補(bǔ)氣健脾之功效，是吳志奎教授根據(jù)中醫(yī)腎生髓、髓生血理論，以補(bǔ)腎益髓法創(chuàng)制的具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的、唯一用于治療地中海貧血的中藥制劑。本課題組依托多項(xiàng)國家課題和基金的資助，在我國廣西南寧地中海貧血高發(fā)區(qū)開展臨床研究近30年，取得肯定的可重復(fù)的臨床療效［7-10］。該藥由山茱萸、何首烏等11味中藥組成，成分復(fù)雜，目前對該藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法僅有薄層色譜法，標(biāo)準(zhǔn)亟待提高。為確保該品種的質(zhì)量穩(wěn)定、可控，本研究建立了益髓生血顆粒的UPLC指紋圖譜，并對其共有峰進(jìn)行了定性鑒別和藥材歸屬分析，以實(shí)現(xiàn)多成分評(píng)價(jià)益髓生血顆粒質(zhì)量的方法，為探索其治療地中海貧血的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色譜儀(四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器以及Empower 2工作站)、Acquity UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7μm)(美國Waters公司);電子分析天平(德國Sartorius公司)。

1.2 試劑 甲醇、磷酸(均為分析純，北京化學(xué)試劑公司);乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Chemical公司，4 L);屈臣氏蒸餾水。

1.3 樣品 實(shí)驗(yàn)用的益髓生血顆粒系中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)提供(批號(hào)為110124、 110506、 110519、 110602、 110612、110801、111012、111207、120405、120516，編號(hào)為S1～S10)深褐色顆粒，每1 g藥粉相當(dāng)于2.36 g生藥。

1.4 對照品及藥材

1.4.1 對照品 馬錢苷(批號(hào)111640-200604)、二苯乙烯苷(批號(hào) 110844-200607)、補(bǔ)骨脂素(批號(hào) 110739-200613)、異補(bǔ)骨脂素(批號(hào)110738-201012)、芒丙花素(批號(hào)111703-200501)、大黃素(批號(hào)110756-200110)、槲皮素(批號(hào) 100081-200406)、大黃素甲醚(批號(hào)110758-200610)、沒食子酸(批號(hào)110831-200302)均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.4.2 藥材 山茱萸、制何首烏、熟地黃、炙黃芪、黨參、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、雞血藤、阿膠、鱉甲、砂仁均購自本草藥材公司，經(jīng)藥劑科劉起華老師鑒定均為《中國藥典》各項(xiàng)下規(guī)定的藥材品種。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 取益髓生血顆粒1 g，碾碎，精密稱量，置100 mL具塞錐形瓶中，精確加入30 mL甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，取出冷至室溫，擦凈瓶外壁，稱定質(zhì)量，用提取溶劑補(bǔ)足失質(zhì)量，搖勻，濾過，濾液過微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備 取對照品，精密稱定，加甲醇制成對照品溶液，再精密吸取沒食子酸(0.226mg/mL)0.25mL、馬 錢 苷(0.226 mg/mL)0.8 mL、二苯乙烯苷(0.202 mg/mL)0.5 mL、槲皮素(0.182 mg/mL)0.1 mL、補(bǔ)骨脂素(0.13 mg/mL)0.5 mL、異補(bǔ)骨脂素(0.176 mg/mL)0.5 mL、芒柄花素(0.083 mg/mL)0.1 mL、大黃素(0.159 mg/mL)0.1 mL、大黃素甲醚(0.196 mg/mL)0.2 mL于10 mL的量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，濾液作為混合對照品溶液。

2.3 對照藥材溶液的制備 取方中山茱萸、制何首烏、熟地黃、炙黃芪、黨參、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、雞血藤、阿膠、鱉甲、砂仁藥材，按益髓生血顆粒的提取工藝提取各藥材，減壓干燥，并按組方比例及各藥材得膏率稱取各藥材干膏，按樣品溶液的制備方法制備各對照藥材的供試液。

2.4 色譜條件 柱溫30℃;體積流量0.25 mL/min;進(jìn)樣量 3μL;流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1% 磷酸水溶液(B)梯度洗脫，0～8 min(3%～15%A)，8～18 min(15% ～45%A)，18～20 min(45% ～70%A)，20～22 min(70% ～100%A)，22～23 min(100% ～3%A)。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(批號(hào)110801)，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)對6次測定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，其相似度均為0.99以上。以12號(hào)峰(補(bǔ)骨脂素)為對照峰S，考察6次測定的色譜中各共有峰的相對保留時(shí)間及相對ln(峰面積)比值的一致性，結(jié)果顯示兩者的RSD值均小于3%，整個(gè)檢測系統(tǒng)的精密度良好，符合指紋圖譜的要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)110801)，分別在0、2、4、8、12、24 h按 “2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)對6次測定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，其相似度均為0.99以上。以12號(hào)峰(補(bǔ)骨脂素)為對照峰S，考察6次測定的色譜中各共有峰的相對保留時(shí)間及相對ln(峰面積)比值的一致性。各共有峰的相對保留時(shí)間及相對ln(峰面積)的RSD值均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取益髓生血顆粒(批號(hào)110801)共6份，分別按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)對6次測定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，其相似度均為0.99以上。以12號(hào)峰(補(bǔ)骨脂素)為對照峰S，考察6次測定的色譜中各共有峰的相對保留時(shí)間及相對ln(峰面積)比值的一致性。各共有峰的相對保留時(shí)間及相對ln(峰面積)的RSD值均小于3%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.8 指紋圖譜的建立 取10批益髓生血顆粒，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)對10批供試品的色譜圖進(jìn)行比較分析，選擇吸收信號(hào)較強(qiáng)、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、峰形明顯的16個(gè)色譜峰標(biāo)定為共有峰(圖1)。

圖1 10批益髓生血顆粒樣品UPLC色譜圖Fig.1 UPLC characteristic chromatograms of ten batches of samples

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)，將10批樣品數(shù)據(jù)導(dǎo)入該軟件，對選定的16個(gè)特征峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配，得到益髓生血顆粒對照指紋圖譜，各批益髓生血顆粒樣品的UPLC圖譜與對照指紋圖譜比較，并計(jì)算其相似度，結(jié)果表明益髓生血顆粒樣品整體相似度為0.800～1.000，不同批號(hào)之間的成分基本一致(表1)。

表1 10批益髓生血顆粒樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.1 Results of similarities evaluation for ten batches of Yisui Shengxue Granules

選擇色譜峰穩(wěn)定、重復(fù)性好的12號(hào)峰(補(bǔ)骨脂素)為對照峰S，對其特征峰的保留時(shí)間和相對ln(峰面積)進(jìn)行比較統(tǒng)計(jì)分析。從結(jié)果看，各共有峰的保留時(shí)間RSD值為0～0.34%，小于1%，不同批次的藥品同一位置特征峰的保留時(shí)間較為穩(wěn)定，16個(gè)特征峰都能穩(wěn)定出現(xiàn)。但其相對ln(峰面積)的RSD值高達(dá)70%以上，這一結(jié)果說明，各批樣品的16個(gè)特征峰所對應(yīng)的成分量相差較大，這一結(jié)果進(jìn)一步解釋上述與對照圖譜比較，相似度偏低的原因，造成這一現(xiàn)象的原因可能是該制劑前期的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有薄層鑒別，導(dǎo)致原藥材質(zhì)量控制不夠嚴(yán)格，提示我們應(yīng)注重提高該藥質(zhì)量控制的監(jiān)管手段，盡量保證藥品的質(zhì)量穩(wěn)定。

2.9 益髓生血顆粒樣品中共有峰的歸屬分析

2.9.1 對照品對照分析 取益髓生血顆粒樣品以及“2.2”項(xiàng)下的混合對照品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，通過保留時(shí)間與UV光譜的對照分析，確定了各峰的歸屬，具體見圖2。

圖2 益髓生血顆粒指紋圖譜與各對照品的色譜比較圖Fig.2 Comparison of UPLC characteristic chromatograms of Yisui Shengxue Granules and compound standard

2.9.2 益髓生血顆粒樣品中共有峰的藥材歸屬分析 取益髓生血顆粒及“2.3”項(xiàng)下組方藥材的供試品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，以保留時(shí)間和UV光譜確認(rèn)各共有峰的來源(圖3)?？梢钥闯?，其中1～5、8號(hào)峰來自山茱萸，1、3、7、9、15、16號(hào)峰來自何首烏，來自君藥的色譜峰共10個(gè)，占總色譜峰的62.5%;2、3號(hào)峰來自熟地黃，6、7、12、13號(hào)峰來自補(bǔ)骨脂，8、10、11、14號(hào)峰來自黃芪，2號(hào)峰來自黨參，2、8號(hào)峰來自當(dāng)歸，來自臣藥的色譜峰共10個(gè)，占總色譜峰的62.5%，10、14號(hào)峰來自雞血藤，來自佐藥的色譜峰共2個(gè)，占總色譜峰的12.5%。在當(dāng)前的色譜條件下，阿膠、鱉甲樣品中無相應(yīng)色譜峰被檢出，砂仁沒有色譜峰顯示在共有模式中。

圖3 益髓生血顆粒與單味藥材UPLC色譜圖比較Fig.3 Comparison of UPLC characteristic chromatograms of Yisui Shengxue Granules and single Chinese medicine

3 討論

地中海貧血是世界范圍內(nèi)發(fā)病率高、危害大的單基因遺傳病，西方醫(yī)學(xué)尚無確切有效的治療方法［11］。益髓生血顆粒是目前唯一用于治療該病的中藥制劑，本課題組多年的療效機(jī)制研究顯示，該藥通過修飾、調(diào)節(jié)基因表達(dá)和基因產(chǎn)物功能，獲得無副作用和后遺癥的顯著療效［12-15］。為了更好地控制益髓生血顆粒質(zhì)量，探討其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)開展了該藥指紋圖譜的研究。研究初期，曾用普通的高效液相色譜儀檢測，分析樣品用時(shí)達(dá)80 min，本實(shí)驗(yàn)所采用的UPLC方法，靈敏度高，同樣的梯度洗脫系統(tǒng)，其用時(shí)僅為普通液相色譜的四分之一，且該色譜方法性能穩(wěn)定，具有可重復(fù)性。

在確定的色譜條件下，比較10批樣品的色譜圖，建立了益髓生血顆粒甲醇提取物的UPLC指紋圖譜，標(biāo)定了16個(gè)共有峰，通過對照品比對，確定其中9個(gè)色譜峰分別為沒食子酸、馬錢苷、二苯乙烯苷、槲皮素、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、芒柄花素、大黃素、大黃素甲醚。通過與各單味藥材樣品色譜圖的比較，基本確定16個(gè)共有峰的藥材歸屬為:來自君藥山茱萸和何首烏共10個(gè)，占總色譜峰的62.5%;來自臣藥熟地黃、黃芪、黨參、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂共10個(gè)峰，占總色譜峰的62.5%，來自佐藥的色譜峰共2個(gè)，占總色譜峰的12.5%。

10批益髓生血顆粒色譜峰中16個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的計(jì)算比較顯示，不同批號(hào)之間的成分基本一致，各共有峰的出峰時(shí)間穩(wěn)定，但各批樣品中共有峰所對應(yīng)的化合物的量波動(dòng)較大。這可能是因?yàn)樵幉牡漠a(chǎn)地、炮制加工的差別所致，提示應(yīng)當(dāng)提高原藥材檢查的力度，盡量固定藥材來源，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，保證藥品的質(zhì)量穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果使益髓生血顆粒中尚不明確的各個(gè)成分由無序到有序，各個(gè)色譜峰的歸屬明確，來源清晰，并確定其中9種成分，對于已知成分可進(jìn)行定量測定，通過未知成分的相對保留時(shí)間與相對峰面積等參數(shù)，可以較為客觀地評(píng)價(jià)益髓生血顆粒的內(nèi)在質(zhì)量，同時(shí)也為進(jìn)一步開展其該藥進(jìn)入體內(nèi)成分研究、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的確定以及配伍規(guī)律的解析等奠定了基礎(chǔ)。

［1］劉朝燊，王冬梅，白 潔，等.色譜技術(shù)在中藥指紋圖譜研究中的應(yīng)用［J］.色譜，2003，21(6):572.

［2］徐 翔，龔 瑛.發(fā)達(dá)國家中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和我國的中藥現(xiàn)代化［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2006，40(3):50.

［3］易延逵，陳志良，鄧虹珠.中藥指紋圖譜的研究評(píng)析［J］.中成藥，2006，28(8):1192.

［4］謝培山.芻議中藥指紋圖譜的現(xiàn)狀、發(fā)展和問題［J］.中藥材，2007，30(3):257.

［5］任德權(quán).中藥指紋圖譜質(zhì)控技術(shù)的意義與作用［J］.中藥材，2001，24(4):235-239.

［6］任德權(quán).中藥質(zhì)量控制的里程碑——中藥指紋圖譜［J］.中成藥，2001，23(1):1-2.

［7］吳志奎，張新華，王 蕾，等.益髓生血靈治療β-地中海貧血癥92例臨床研究［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11(4):292-293.

［8］夏愛軍，周天紅，王 麗，等.中藥益髓生血顆粒治療地中海貧血的臨床研究［J］.華南國防醫(yī)學(xué)雜志，2008，22(1):25-27.

［9］吳志奎，劉詠梅，張新華，等.補(bǔ)腎益髓法治療β-地中海貧血的平行對照臨床研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2007，5(2):137-140.

［10］吳志奎，張新華，李 敏，等.益髓生血顆粒治療β-地中海貧血患者自身對照比較研究［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14(3):9-11.

［11］李津嬰，萬樹棟，閔碧荷.地中海貧血治療研究方向和藥物治療研究進(jìn)展［J］.中華血液學(xué)雜志，2002，23(11):605-607.

［12］Fang S P，Wu Z K，Zhang X H，et al.Yisui Shengxue Granule on treating 156 patients with Thalassemia major and the molecu-lar mechanism study［J］.Biol Pharm Bull，2007，30(11):2084-2087.

［13］劉詠梅，吳志奎，柴立民，等.中藥益髓生血顆粒對β-地中海貧血患者骨髓α血紅蛋白穩(wěn)定蛋白及紅系轉(zhuǎn)錄因子GATA-1基因表達(dá)的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2006，4(3):247-250.

［14］易 杰，吳志奎，黃啟福，等.益髓生血顆粒對β-地中海貧血患者SCF及EPOR mRNA表達(dá)的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2004，31(3):197-199.

［15］程艷玲，張新華，孫玉雯，等.補(bǔ)腎益髓法治療β-地中海貧血的現(xiàn)狀［J］.中醫(yī)雜志，2013，54(2):155-159.