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    益髓生血顆粒特定指紋圖譜及特征峰分析

    2014-11-01 03:18:10孫玉雯劉起華吳志奎
    中成藥 2014年1期
    關(guān)鍵詞:生血號(hào)峰指紋

    孫玉雯,劉起華,文 謹(jǐn),吳志奎

    (中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院,北京 100053)

    中藥是典型的復(fù)雜體系,具有多組分與多靶點(diǎn)的特點(diǎn),在目前對其臨床療效了解較多而作用機(jī)制尚未完全明了的情況下,僅以某一指標(biāo)性成分的定性或定量來評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量是不全面的[1]。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的質(zhì)量控制手段,其基本屬性是整體性和模糊性[2-4],這與中醫(yī)理論的整體性原則和中藥作用機(jī)制的模糊性是相對應(yīng)的,因此指紋圖譜已成為國際公認(rèn)的控制中藥和天然藥物質(zhì)量的最有效手段[5-6]。

    益髓生血顆粒具有滋陰補(bǔ)腎、益髓生血、補(bǔ)氣健脾之功效,是吳志奎教授根據(jù)中醫(yī)腎生髓、髓生血理論,以補(bǔ)腎益髓法創(chuàng)制的具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的、唯一用于治療地中海貧血的中藥制劑。本課題組依托多項(xiàng)國家課題和基金的資助,在我國廣西南寧地中海貧血高發(fā)區(qū)開展臨床研究近30年,取得肯定的可重復(fù)的臨床療效[7-10]。該藥由山茱萸、何首烏等11味中藥組成,成分復(fù)雜,目前對該藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法僅有薄層色譜法,標(biāo)準(zhǔn)亟待提高。為確保該品種的質(zhì)量穩(wěn)定、可控,本研究建立了益髓生血顆粒的UPLC指紋圖譜,并對其共有峰進(jìn)行了定性鑒別和藥材歸屬分析,以實(shí)現(xiàn)多成分評(píng)價(jià)益髓生血顆粒質(zhì)量的方法,為探索其治療地中海貧血的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器 Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色譜儀(四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器以及Empower 2工作站)、Acquity UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7μm)(美國Waters公司);電子分析天平(德國Sartorius公司)。

    1.2 試劑 甲醇、磷酸(均為分析純,北京化學(xué)試劑公司);乙腈(色譜純,F(xiàn)isher Chemical公司,4 L);屈臣氏蒸餾水。

    1.3 樣品 實(shí)驗(yàn)用的益髓生血顆粒系中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)提供(批號(hào)為110124、 110506、 110519、 110602、 110612、110801、111012、111207、120405、120516,編號(hào)為S1~S10)深褐色顆粒,每1 g藥粉相當(dāng)于2.36 g生藥。

    1.4 對照品及藥材

    1.4.1 對照品 馬錢苷(批號(hào)111640-200604)、二苯乙烯苷(批號(hào) 110844-200607)、補(bǔ)骨脂素(批號(hào) 110739-200613)、異補(bǔ)骨脂素(批號(hào)110738-201012)、芒丙花素(批號(hào)111703-200501)、大黃素(批號(hào)110756-200110)、槲皮素(批號(hào) 100081-200406)、大黃素甲醚(批號(hào)110758-200610)、沒食子酸(批號(hào)110831-200302)均購自中國藥品生物制品檢定所。

    1.4.2 藥材 山茱萸、制何首烏、熟地黃、炙黃芪、黨參、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、雞血藤、阿膠、鱉甲、砂仁均購自本草藥材公司,經(jīng)藥劑科劉起華老師鑒定均為《中國藥典》各項(xiàng)下規(guī)定的藥材品種。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 供試品溶液的制備 取益髓生血顆粒1 g,碾碎,精密稱量,置100 mL具塞錐形瓶中,精確加入30 mL甲醇,密塞,稱定質(zhì)量,超聲提取30 min,取出冷至室溫,擦凈瓶外壁,稱定質(zhì)量,用提取溶劑補(bǔ)足失質(zhì)量,搖勻,濾過,濾液過微孔濾膜,即得供試品溶液。

    2.2 對照品溶液的制備 取對照品,精密稱定,加甲醇制成對照品溶液,再精密吸取沒食子酸(0.226mg/mL)0.25mL、馬 錢 苷(0.226 mg/mL)0.8 mL、二苯乙烯苷(0.202 mg/mL)0.5 mL、槲皮素(0.182 mg/mL)0.1 mL、補(bǔ)骨脂素(0.13 mg/mL)0.5 mL、異補(bǔ)骨脂素(0.176 mg/mL)0.5 mL、芒柄花素(0.083 mg/mL)0.1 mL、大黃素(0.159 mg/mL)0.1 mL、大黃素甲醚(0.196 mg/mL)0.2 mL于10 mL的量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,微孔濾膜濾過,濾液作為混合對照品溶液。

    2.3 對照藥材溶液的制備 取方中山茱萸、制何首烏、熟地黃、炙黃芪、黨參、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、雞血藤、阿膠、鱉甲、砂仁藥材,按益髓生血顆粒的提取工藝提取各藥材,減壓干燥,并按組方比例及各藥材得膏率稱取各藥材干膏,按樣品溶液的制備方法制備各對照藥材的供試液。

    2.4 色譜條件 柱溫30℃;體積流量0.25 mL/min;進(jìn)樣量 3μL;流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1% 磷酸水溶液(B)梯度洗脫,0~8 min(3%~15%A),8~18 min(15% ~45%A),18~20 min(45% ~70%A),20~22 min(70% ~100%A),22~23 min(100% ~3%A)。

    2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(批號(hào)110801),連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次,按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測,采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)對6次測定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算,其相似度均為0.99以上。以12號(hào)峰(補(bǔ)骨脂素)為對照峰S,考察6次測定的色譜中各共有峰的相對保留時(shí)間及相對ln(峰面積)比值的一致性,結(jié)果顯示兩者的RSD值均小于3%,整個(gè)檢測系統(tǒng)的精密度良好,符合指紋圖譜的要求。

    2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)110801),分別在0、2、4、8、12、24 h按 “2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測,采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)對6次測定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算,其相似度均為0.99以上。以12號(hào)峰(補(bǔ)骨脂素)為對照峰S,考察6次測定的色譜中各共有峰的相對保留時(shí)間及相對ln(峰面積)比值的一致性。各共有峰的相對保留時(shí)間及相對ln(峰面積)的RSD值均小于3%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取益髓生血顆粒(批號(hào)110801)共6份,分別按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測,采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)對6次測定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算,其相似度均為0.99以上。以12號(hào)峰(補(bǔ)骨脂素)為對照峰S,考察6次測定的色譜中各共有峰的相對保留時(shí)間及相對ln(峰面積)比值的一致性。各共有峰的相對保留時(shí)間及相對ln(峰面積)的RSD值均小于3%,表明本方法的重復(fù)性良好。

    2.8 指紋圖譜的建立 取10批益髓生血顆粒,按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,并按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測,記錄色譜圖,采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)對10批供試品的色譜圖進(jìn)行比較分析,選擇吸收信號(hào)較強(qiáng)、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、峰形明顯的16個(gè)色譜峰標(biāo)定為共有峰(圖1)。

    圖1 10批益髓生血顆粒樣品UPLC色譜圖Fig.1 UPLC characteristic chromatograms of ten batches of samples

    采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版),將10批樣品數(shù)據(jù)導(dǎo)入該軟件,對選定的16個(gè)特征峰進(jìn)行多點(diǎn)校正,自動(dòng)匹配,得到益髓生血顆粒對照指紋圖譜,各批益髓生血顆粒樣品的UPLC圖譜與對照指紋圖譜比較,并計(jì)算其相似度,結(jié)果表明益髓生血顆粒樣品整體相似度為0.800~1.000,不同批號(hào)之間的成分基本一致(表1)。

    表1 10批益髓生血顆粒樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.1 Results of similarities evaluation for ten batches of Yisui Shengxue Granules

    選擇色譜峰穩(wěn)定、重復(fù)性好的12號(hào)峰(補(bǔ)骨脂素)為對照峰S,對其特征峰的保留時(shí)間和相對ln(峰面積)進(jìn)行比較統(tǒng)計(jì)分析。從結(jié)果看,各共有峰的保留時(shí)間RSD值為0~0.34%,小于1%,不同批次的藥品同一位置特征峰的保留時(shí)間較為穩(wěn)定,16個(gè)特征峰都能穩(wěn)定出現(xiàn)。但其相對ln(峰面積)的RSD值高達(dá)70%以上,這一結(jié)果說明,各批樣品的16個(gè)特征峰所對應(yīng)的成分量相差較大,這一結(jié)果進(jìn)一步解釋上述與對照圖譜比較,相似度偏低的原因,造成這一現(xiàn)象的原因可能是該制劑前期的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有薄層鑒別,導(dǎo)致原藥材質(zhì)量控制不夠嚴(yán)格,提示我們應(yīng)注重提高該藥質(zhì)量控制的監(jiān)管手段,盡量保證藥品的質(zhì)量穩(wěn)定。

    2.9 益髓生血顆粒樣品中共有峰的歸屬分析

    2.9.1 對照品對照分析 取益髓生血顆粒樣品以及“2.2”項(xiàng)下的混合對照品溶液,按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測,通過保留時(shí)間與UV光譜的對照分析,確定了各峰的歸屬,具體見圖2。

    圖2 益髓生血顆粒指紋圖譜與各對照品的色譜比較圖Fig.2 Comparison of UPLC characteristic chromatograms of Yisui Shengxue Granules and compound standard

    2.9.2 益髓生血顆粒樣品中共有峰的藥材歸屬分析 取益髓生血顆粒及“2.3”項(xiàng)下組方藥材的供試品溶液,按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測,以保留時(shí)間和UV光譜確認(rèn)各共有峰的來源(圖3)??梢钥闯?,其中1~5、8號(hào)峰來自山茱萸,1、3、7、9、15、16號(hào)峰來自何首烏,來自君藥的色譜峰共10個(gè),占總色譜峰的62.5%;2、3號(hào)峰來自熟地黃,6、7、12、13號(hào)峰來自補(bǔ)骨脂,8、10、11、14號(hào)峰來自黃芪,2號(hào)峰來自黨參,2、8號(hào)峰來自當(dāng)歸,來自臣藥的色譜峰共10個(gè),占總色譜峰的62.5%,10、14號(hào)峰來自雞血藤,來自佐藥的色譜峰共2個(gè),占總色譜峰的12.5%。在當(dāng)前的色譜條件下,阿膠、鱉甲樣品中無相應(yīng)色譜峰被檢出,砂仁沒有色譜峰顯示在共有模式中。

    圖3 益髓生血顆粒與單味藥材UPLC色譜圖比較Fig.3 Comparison of UPLC characteristic chromatograms of Yisui Shengxue Granules and single Chinese medicine

    3 討論

    地中海貧血是世界范圍內(nèi)發(fā)病率高、危害大的單基因遺傳病,西方醫(yī)學(xué)尚無確切有效的治療方法[11]。益髓生血顆粒是目前唯一用于治療該病的中藥制劑,本課題組多年的療效機(jī)制研究顯示,該藥通過修飾、調(diào)節(jié)基因表達(dá)和基因產(chǎn)物功能,獲得無副作用和后遺癥的顯著療效[12-15]。為了更好地控制益髓生血顆粒質(zhì)量,探討其藥效物質(zhì)基礎(chǔ),本實(shí)驗(yàn)開展了該藥指紋圖譜的研究。研究初期,曾用普通的高效液相色譜儀檢測,分析樣品用時(shí)達(dá)80 min,本實(shí)驗(yàn)所采用的UPLC方法,靈敏度高,同樣的梯度洗脫系統(tǒng),其用時(shí)僅為普通液相色譜的四分之一,且該色譜方法性能穩(wěn)定,具有可重復(fù)性。

    在確定的色譜條件下,比較10批樣品的色譜圖,建立了益髓生血顆粒甲醇提取物的UPLC指紋圖譜,標(biāo)定了16個(gè)共有峰,通過對照品比對,確定其中9個(gè)色譜峰分別為沒食子酸、馬錢苷、二苯乙烯苷、槲皮素、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、芒柄花素、大黃素、大黃素甲醚。通過與各單味藥材樣品色譜圖的比較,基本確定16個(gè)共有峰的藥材歸屬為:來自君藥山茱萸和何首烏共10個(gè),占總色譜峰的62.5%;來自臣藥熟地黃、黃芪、黨參、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂共10個(gè)峰,占總色譜峰的62.5%,來自佐藥的色譜峰共2個(gè),占總色譜峰的12.5%。

    10批益髓生血顆粒色譜峰中16個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的計(jì)算比較顯示,不同批號(hào)之間的成分基本一致,各共有峰的出峰時(shí)間穩(wěn)定,但各批樣品中共有峰所對應(yīng)的化合物的量波動(dòng)較大。這可能是因?yàn)樵幉牡漠a(chǎn)地、炮制加工的差別所致,提示應(yīng)當(dāng)提高原藥材檢查的力度,盡量固定藥材來源,優(yōu)化生產(chǎn)工藝,保證藥品的質(zhì)量穩(wěn)定。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果使益髓生血顆粒中尚不明確的各個(gè)成分由無序到有序,各個(gè)色譜峰的歸屬明確,來源清晰,并確定其中9種成分,對于已知成分可進(jìn)行定量測定,通過未知成分的相對保留時(shí)間與相對峰面積等參數(shù),可以較為客觀地評(píng)價(jià)益髓生血顆粒的內(nèi)在質(zhì)量,同時(shí)也為進(jìn)一步開展其該藥進(jìn)入體內(nèi)成分研究、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的確定以及配伍規(guī)律的解析等奠定了基礎(chǔ)。

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