朱艷艷 俞建平 趙瑞力
扭曲基因(Twist)是一種在胚胎發(fā)生中起關(guān)鍵調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子,有癌基因特征,能編碼程序性細胞死亡抑制蛋白和介導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition,EMT),從而促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[1]。EMT是指上皮細胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生成纖維細胞或間充質(zhì)細胞表型的轉(zhuǎn)變并獲得遷移的能力,多發(fā)生在胚胎發(fā)育早期及癌轉(zhuǎn)移的過程中[2]。EMT發(fā)生時常伴有上皮型鈣黏附蛋白(E-cadherin)表達下降及神經(jīng)型鈣黏附蛋白(N-cadherin)升高。本實驗采用免疫組織化學(xué)SP法及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptional polymerase chain reaction,RT-PCR)方法檢測 Twist在喉鱗癌(laryngealsquamouscell carcinoma,LSCC)及癌旁組織中的表達,并探討Twist與E-cadherin、N-cadherin在LSCC的發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)性。
1.1 標本 取自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2008年2月~2009年12月耳鼻喉科的喉癌標本,一部分液氮保存用于RNA的提取;另一部分10%甲醛固定用于免疫組織化學(xué)。癌旁組織共20例(距癌組織切緣>0.5 cm,經(jīng)病理證實為炎癥或正常黏膜),喉癌標本共49例,均病理證實為鱗癌,其中男性47例、女性2例;高分化(G1)17例、中分化(G2)21例、低分化(G3)11例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N+)15例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0)34例;臨床分期采用國際抗癌協(xié)會(UICC)2001年公布的TNM分類分期標準Ⅰ、Ⅱ期18例,Ⅲ、Ⅳ期31例;聲門上型33例,聲門型16例。年齡36~75歲,中位年齡60歲。全部患者術(shù)前均未接受放化療,臨床資料完整。
1.2 試劑與方法
1.2.1 免疫組織化學(xué) Twist鼠單克隆抗體:sc-81417 Santa Cruz Biotechnology Inc,E-cadherin鼠單克隆抗體:Gene Tech (Shanghai)Company Limited,N-cadherin鼠單克隆抗體:ZM-0094北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。鼠二抗免疫組織化學(xué)試劑盒:SP-9002北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。DAB顯色液:ZLI-9032北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。采用免疫組織化學(xué)SP法,Twist、E-cadherin采用EDTA緩沖工作液進行抗原修復(fù),N-cadherin采用枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原修復(fù),均用高壓熱修復(fù)預(yù)處理。PBS代替一抗作為陰性對照,用已知陽性組織切片(乳腺癌)作為陽性對照。
1.2.2 RT-PCR 組織總 RNA提取試劑TRIzol(SBS Corporation,美國);總 RNA提取試劑(total RNA isolation reagent,Promega Corporation,美國);反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒 M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Promega Corporation,美國);DNA MarkerⅠ II北京Solarbio科學(xué)技術(shù)有限公司;綠色體系 (Promega Corporation,美國)。提取 RNA后取6 μL經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA后行PCR。引物合成引自文獻[3],PCR引物序列及反應(yīng)條件見表1。將擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)分析并拍攝。
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。免疫組織化學(xué)結(jié)果采用χ2檢驗,mRNA數(shù)據(jù)以表示,兩組間的比較采用 t檢驗;相關(guān)性分析用Spearman等級相關(guān)分析和直線相關(guān)分析。采用雙側(cè)檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
表1 PCR引物及反應(yīng)條件
2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果(圖1~4及表2)Twist蛋白表達呈棕褐色,定位于細胞質(zhì)及細胞核,以細胞質(zhì)為主,以出現(xiàn)片狀或顆粒狀的胞質(zhì)或胞核著色為陽性細胞(圖1);Twist在喉癌旁組織中表達為陰性(圖2)。N-cadherin陽性表達以胞質(zhì)著色為主 (圖3),呈明顯的棕黃色顆粒。采用半定量記分法,隨機選取5個高倍視野(×400),按陽性著色程度評分:0分為無著色;1分為淺黃色;2分為棕黃色;3分為棕褐色。再按陽性細胞所占比例評分:0分為陰性;1分為<10%;2分為11%~50%;3分為51%~75%;4分為>75%;以兩者乘積判定結(jié)果:4~12分定為陽性,4分以下定為陰性。E-cadherin陽性表達以胞膜著色為主(圖4),呈棕黃色顆粒狀或線狀,以出現(xiàn)均勻完整的胞膜著色定為陽性細胞。參照Fromowitz評分標準,隨機選取5個高倍視野(×400)計數(shù)腫瘤細胞總數(shù)和陽性細胞數(shù),得出陽性細胞百分率,其中陽性細胞率≤25%為0分,26% ~50%為1分,51% ~75%為2分,>75%為3分;再按多數(shù)陽性細胞呈現(xiàn)的染色強度予以記分:無顯色為0分,淺棕黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。將上述2項得分相加:0分判為“-”,1~2分判為“+”,3~4分判為“++”,5~6分判為“+++”。E-cadherin以“++”和“+++”為正常表達,>10%細胞出現(xiàn)胞質(zhì)和(或)核表達定義為“-”。“-”、“+”皆歸為異常表達。
圖1.Twist在喉癌組織中的表達
圖2.Twist在喉癌旁組織中的表達
圖3.N-cadherin在喉癌組織中的表達
圖4.E-cadherin在喉癌組織中的表達
表2 Twist,E-cadherin,N-cadherin 在喉癌組織中的蛋白表達和臨床參數(shù)間的關(guān)系
Twist蛋白陽性在喉癌組織中的陽性表達率61.22%(30/49)明顯高于癌旁組織的25%(5/20),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);在喉鱗癌中,Twist的蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N+組高于N0組,P<0.05)、臨床分期(Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期,P<0.01)相關(guān),與腫瘤病理學(xué)分級、臨床分型及年齡分組無關(guān)(P>0.05)。E-cadherin在喉癌組織中的陽性表達率51.02%(25/49)明顯低于癌旁組織的100.00%(20/20),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);在喉癌中,E-cadherin的表達與腫瘤病理學(xué)分級(G1、G2組高于 G3組,P <0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0組高于 N+組,P <0.01)和臨床分期(Ⅰ、Ⅱ期高于Ⅲ、Ⅳ期,P<0.01)相關(guān),而與臨床分型及年齡分組無關(guān)(P>0.05)。N-cadherin在喉癌組織中的陽性表達率73.47%(36/49)明顯高于癌旁組織的 40.00%(8/20),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);在喉鱗癌中,N-cadherin蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N+組高于N0組,P<0.05)、臨床分期(Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期,P <0.01)及年齡分組(≤60歲組高于>60歲組,P<0.05)相關(guān),而與腫瘤病理學(xué)分級及臨床分型分組無關(guān)(P>0.05)。
2.2 RT-PCR結(jié)果 (見圖5-7及表3)
圖5.Twist mRNA在喉癌組織和癌旁組織中的表達
圖6.E-cadherin mRNA在喉癌組織和癌旁組織中的表達
圖7.N-cadherin mRNA在喉癌組織和癌旁組織中的表達
表3 Twist,E-cadherin,N-cadherin在喉癌組織中的mRNA表達和臨床參數(shù)間的關(guān)系
Twist在喉鱗癌組織中 mRNA的相對表達量(0.93 ±0.39)明顯高于癌旁組織(0.57 ±0.24),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);Twist mRNA的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N+組高于N0組,P <0.05)、臨床分期(Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期,P<0.01)相關(guān),與腫瘤病理學(xué)分級、臨床分型及年齡分組無關(guān)(P>0.05)。E-cadherin在喉癌組織中的mRNA相對表達量(0.64±0.30)低于癌旁組織(0.93±0.33),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);在喉鱗癌中,E-cadherin的mRNA表達與腫瘤病理學(xué)分級(G1、G2組高于 G3組,P <0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0組高于 N+組,P<0.01)和臨床分期(Ⅰ、Ⅱ期高于Ⅲ、Ⅳ期,P<0.05)相關(guān),與臨床分型及年齡分組無關(guān)(P>0.05)。N-cadherin在喉癌組織中的mRNA相對表達量(0.70 ±0.21)高于癌旁組織(0.36 ±0.11),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);喉鱗癌中,N-cadherin的mRNA表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N+組高于 N0組,P<0.05)、臨床分期(Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期,P <0.01)相關(guān),與腫瘤病理學(xué)分級、臨床分型、年齡分組無關(guān)(P>0.05)。
2.3 3種基因mRNA及蛋白表達相關(guān)性 在mRNA水平及蛋白水平,Twist與 E-cadherin(r=-0.760,P <0.01;r=-0.662,P < 0.01),N-cadherin 與 E-cadherin(r=-0.615,P <0.01;r=-0.558,P <0.01)的表達均呈負相關(guān);Twist與N-cadherin均呈正相關(guān)(r=0.850,P <0.01;r=0.649,P <0.01)。
Twist屬于螺-環(huán)-螺(basic helix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族,可調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過程中的細胞重建,并賦予細胞遷移的能力。2004年Yang等[4]在小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型中發(fā)現(xiàn)Twist的重要作用,體外實驗證實了Twist與EMT現(xiàn)象及腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性,從而引發(fā)了人們對于腫瘤中Twist作用的關(guān)注。
本實驗發(fā)現(xiàn)無論在mRNA還是在蛋白水平,Twist在喉癌組織的表達都比癌旁組織明顯升高,表明Twist可能參與喉癌的發(fā)生,其原因可能是Twist能夠抑制細胞凋亡。Twist通過抑制P53蛋白活性,影響P53介導(dǎo)的凋亡通路來抑制凋亡的機制已被證實[5]。另外,Twist還可通過對Akt途徑的正性調(diào)控作用抑制凋亡。有研究發(fā)現(xiàn),以RNA干擾技術(shù)沉默Twist基因后可增強紫杉醇誘導(dǎo)的鼻咽癌細胞凋亡。目前已在多種人類上皮來源腫瘤中發(fā)現(xiàn)Twist表達增高,并與患者預(yù)后關(guān)系密切,如子宮頸癌[6]、乳腺癌[7]等,而在喉癌組織中的研究國內(nèi)還少見相關(guān)報道。
本實驗對Twist在喉癌組織中的mRNA和蛋白的表達和臨床各參數(shù)之間的關(guān)系進行研究發(fā)現(xiàn),Twist的表達率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,臨床分期Ⅲ、Ⅳ期組高于Ⅰ、Ⅱ期組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示Twist在喉癌的浸潤轉(zhuǎn)移過程中也起重要作用。這與Song等[8]關(guān)于Twist表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究結(jié)果一致。Yuen等[9]發(fā)現(xiàn)Twist胞核內(nèi)表達對原發(fā)前列腺癌轉(zhuǎn)移潛能的判斷有意義。我們在實驗中也發(fā)現(xiàn)Twist在核表達呈強陽性的3例標本中均伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,提示Twist在胞核內(nèi)表達增高也可能對喉癌轉(zhuǎn)移潛能的判斷有意義,但因本實驗Twist在核表達為強陽性的樣本數(shù)較少,尚無統(tǒng)計學(xué)意義。Ou等[10]對50例頭頸部鱗癌組織進行免疫組織化學(xué)分析,證實Twist陽性表達和腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及疾病進展密切相關(guān),但準確的調(diào)節(jié)機制需進一步研究。
E-cadherin及N-cadherin是鈣黏附分子家族中與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系最密切的2種,本實驗發(fā)現(xiàn)雖然E-cadherin在喉癌和癌旁組織中均有表達,但E-cadherin在喉癌中不僅表達減少,且以胞質(zhì)表達為主,胞膜表達不明顯。這可能是因為此時E-cadherin雖有合成,但不能良好表達于細胞膜,發(fā)揮應(yīng)有的黏附作用。對喉癌組織中E-cadherin的表達與喉癌臨床參數(shù)的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn),無論mRNA還是蛋白的表達都與腫瘤病理學(xué)分級、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān),均提示E-cadherin表達下調(diào)或缺失參與了喉癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移。
本實驗對N-cadherin表達研究發(fā)現(xiàn),在蛋白和mRNA水平喉癌中都較癌旁組織升高,并與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)。實驗中還發(fā)現(xiàn)N-cadherin的蛋白表達與年齡相關(guān),但mRNA與年齡無關(guān),以往并無證據(jù)表明N-cadherin的蛋白表達與年齡相關(guān),故推斷可能是由于統(tǒng)計中的抽樣誤差造成,該結(jié)論需進一步驗證。有研究顯示,N-cadherin在胞核或胞質(zhì)中高表達可引起癌基因c-erbB1的蛋白表達產(chǎn)物EGFR作用持續(xù)增強。當EGF與之結(jié)合后可刺激細胞分裂和增殖,從而促進某些腫瘤形成。N-cadherin的高表達還可以激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),誘導(dǎo)MMP-9基因表達,促進腫瘤血管形成,使腫瘤易于生長和轉(zhuǎn)移。
本實驗發(fā)現(xiàn)在mRNA和蛋白水平上都存在Twist和 E-cadherin負相關(guān),Twist與 N-cadherin正相關(guān),E-cadherin和N-cadherin負相關(guān)。Twist通過調(diào)控EMT來促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移已在乳腺癌[11]、甲狀旁腺癌[12]等多種腫瘤中被證實。EMT的特征是上皮性標記丟失如 E-cadherin,而獲得間質(zhì)細胞的標記如N-cadherin,vimetin,smooth muscle actin。一些基因如Twist,snail,sip1,slug 等能夠誘導(dǎo) EMT,其共同特征是含有靶基因啟動子上的E-box基因序列的DNA結(jié)合序列。
但在Twist高表達的狗腎內(nèi)皮細胞中轉(zhuǎn)入并表達E-cadherin并不能誘導(dǎo)EMT的逆轉(zhuǎn)[4],說明Twist的作用機制絕非僅僅是抑制E-cadherin,可能涉及其他基因和細胞因子。Huber等[13]發(fā)現(xiàn) Twist既可直接與E-cadherin啟動子區(qū)的E-box結(jié)合,從轉(zhuǎn)錄水平上抑制E-cadherin的表達,又可通過非轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)使細胞黏著蛋白和纖連蛋白表達增高來增加腫瘤細胞侵襲力。在胚胎發(fā)育過程中,Twist能促進 N-cadherin的表達,N-cadherin的增加進一步導(dǎo)致E-cadherin的表達下降;而N-cadherin在細胞間的連接作用要明顯低于E-cadherin,所以當N-cadherin的表達增高后,腫瘤細胞的能力就會明顯提高。以上均提示Twist可能通過上調(diào)N-cadherin和下調(diào)E-cadherin介導(dǎo)EMT發(fā)生,從而參與喉癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移。3種基因的聯(lián)合檢測可較好反映腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為,為指導(dǎo)臨床治療和腫瘤基因治療提供重要的臨床參考價值。
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