喉鱗癌中扭曲基因、上皮型鈣黏附蛋白和神經(jīng)型鈣黏附蛋白基因表達(dá)及相關(guān)研究

朱艷艷 俞建平 趙瑞力

扭曲基因(Twist)是一種在胚胎發(fā)生中起關(guān)鍵調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，有癌基因特征，能編碼程序性細(xì)胞死亡抑制蛋白和介導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition，EMT)，從而促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［1］。EMT是指上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生成纖維細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變并獲得遷移的能力，多發(fā)生在胚胎發(fā)育早期及癌轉(zhuǎn)移的過程中［2］。EMT發(fā)生時(shí)常伴有上皮型鈣黏附蛋白(E-cadherin)表達(dá)下降及神經(jīng)型鈣黏附蛋白(N-cadherin)升高。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)SP法及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptional polymerase chain reaction，RT-PCR)方法檢測 Twist在喉鱗癌(laryngealsquamouscell carcinoma，LSCC)及癌旁組織中的表達(dá)，并探討Twist與E-cadherin、N-cadherin在LSCC的發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 取自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2008年2月～2009年12月耳鼻喉科的喉癌標(biāo)本，一部分液氮保存用于RNA的提取;另一部分10%甲醛固定用于免疫組織化學(xué)。癌旁組織共20例(距癌組織切緣＞0.5 cm，經(jīng)病理證實(shí)為炎癥或正常黏膜)，喉癌標(biāo)本共49例，均病理證實(shí)為鱗癌，其中男性47例、女性2例;高分化(G1)17例、中分化(G2)21例、低分化(G3)11例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N+)15例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0)34例;臨床分期采用國際抗癌協(xié)會(UICC)2001年公布的TNM分類分期標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ、Ⅱ期18例，Ⅲ、Ⅳ期31例;聲門上型33例，聲門型16例。年齡36～75歲，中位年齡60歲。全部患者術(shù)前均未接受放化療，臨床資料完整。

1.2 試劑與方法

1.2.1 免疫組織化學(xué) Twist鼠單克隆抗體:sc-81417 Santa Cruz Biotechnology Inc，E-cadherin鼠單克隆抗體:Gene Tech (Shanghai)Company Limited，N-cadherin鼠單克隆抗體:ZM-0094北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。鼠二抗免疫組織化學(xué)試劑盒:SP-9002北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。DAB顯色液:ZLI-9032北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。采用免疫組織化學(xué)SP法，Twist、E-cadherin采用EDTA緩沖工作液進(jìn)行抗原修復(fù)，N-cadherin采用枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，均用高壓熱修復(fù)預(yù)處理。PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性組織切片(乳腺癌)作為陽性對照。

1.2.2 RT-PCR 組織總 RNA提取試劑TRIzol(SBS Corporation，美國);總 RNA提取試劑(total RNA isolation reagent，Promega Corporation，美國);反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒 M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Promega Corporation，美國);DNA MarkerⅠ II北京Solarbio科學(xué)技術(shù)有限公司;綠色體系 (Promega Corporation，美國)。提取 RNA后取6 μL經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA后行PCR。引物合成引自文獻(xiàn)［3］，PCR引物序列及反應(yīng)條件見表1。將擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析并拍攝。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。免疫組織化學(xué)結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)，mRNA數(shù)據(jù)以表示，兩組間的比較采用 t檢驗(yàn);相關(guān)性分析用Spearman等級相關(guān)分析和直線相關(guān)分析。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PCR引物及反應(yīng)條件

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果(圖1～4及表2)Twist蛋白表達(dá)呈棕褐色，定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，以細(xì)胞質(zhì)為主，以出現(xiàn)片狀或顆粒狀的胞質(zhì)或胞核著色為陽性細(xì)胞(圖1);Twist在喉癌旁組織中表達(dá)為陰性(圖2)。N-cadherin陽性表達(dá)以胞質(zhì)著色為主 (圖3)，呈明顯的棕黃色顆粒。采用半定量記分法，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，按陽性著色程度評分:0分為無著色;1分為淺黃色;2分為棕黃色;3分為棕褐色。再按陽性細(xì)胞所占比例評分:0分為陰性;1分為＜10%;2分為11%～50%;3分為51%～75%;4分為＞75%;以兩者乘積判定結(jié)果:4～12分定為陽性，4分以下定為陰性。E-cadherin陽性表達(dá)以胞膜著色為主(圖4)，呈棕黃色顆粒狀或線狀，以出現(xiàn)均勻完整的胞膜著色定為陽性細(xì)胞。參照Fromowitz評分標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)，得出陽性細(xì)胞百分率，其中陽性細(xì)胞率≤25%為0分，26% ～50%為1分，51% ～75%為2分，＞75%為3分;再按多數(shù)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強(qiáng)度予以記分:無顯色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將上述2項(xiàng)得分相加:0分判為“-”，1～2分判為“+”，3～4分判為“++”，5～6分判為“+++”。E-cadherin以“++”和“+++”為正常表達(dá)，＞10%細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)和(或)核表達(dá)定義為“-”。“-”、“+”皆歸為異常表達(dá)。

圖1.Twist在喉癌組織中的表達(dá)

圖2.Twist在喉癌旁組織中的表達(dá)

圖3.N-cadherin在喉癌組織中的表達(dá)

圖4.E-cadherin在喉癌組織中的表達(dá)

表2 Twist，E-cadherin，N-cadherin 在喉癌組織中的蛋白表達(dá)和臨床參數(shù)間的關(guān)系

Twist蛋白陽性在喉癌組織中的陽性表達(dá)率61.22%(30/49)明顯高于癌旁組織的25%(5/20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);在喉鱗癌中，Twist的蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N+組高于N0組，P＜0.05)、臨床分期(Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期，P＜0.01)相關(guān)，與腫瘤病理學(xué)分級、臨床分型及年齡分組無關(guān)(P＞0.05)。E-cadherin在喉癌組織中的陽性表達(dá)率51.02%(25/49)明顯低于癌旁組織的100.00%(20/20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);在喉癌中，E-cadherin的表達(dá)與腫瘤病理學(xué)分級(G1、G2組高于 G3組，P ＜0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0組高于 N+組，P ＜0.01)和臨床分期(Ⅰ、Ⅱ期高于Ⅲ、Ⅳ期，P＜0.01)相關(guān)，而與臨床分型及年齡分組無關(guān)(P＞0.05)。N-cadherin在喉癌組織中的陽性表達(dá)率73.47%(36/49)明顯高于癌旁組織的 40.00%(8/20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在喉鱗癌中，N-cadherin蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N+組高于N0組，P＜0.05)、臨床分期(Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期，P ＜0.01)及年齡分組(≤60歲組高于＞60歲組，P＜0.05)相關(guān)，而與腫瘤病理學(xué)分級及臨床分型分組無關(guān)(P＞0.05)。

2.2 RT-PCR結(jié)果 (見圖5-7及表3)

圖5.Twist mRNA在喉癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

圖6.E-cadherin mRNA在喉癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

圖7.N-cadherin mRNA在喉癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

表3 Twist，E-cadherin，N-cadherin在喉癌組織中的mRNA表達(dá)和臨床參數(shù)間的關(guān)系

Twist在喉鱗癌組織中 mRNA的相對表達(dá)量(0.93 ±0.39)明顯高于癌旁組織(0.57 ±0.24)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);Twist mRNA的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N+組高于N0組，P ＜0.05)、臨床分期(Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期，P＜0.01)相關(guān)，與腫瘤病理學(xué)分級、臨床分型及年齡分組無關(guān)(P＞0.05)。E-cadherin在喉癌組織中的mRNA相對表達(dá)量(0.64±0.30)低于癌旁組織(0.93±0.33)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);在喉鱗癌中，E-cadherin的mRNA表達(dá)與腫瘤病理學(xué)分級(G1、G2組高于 G3組，P ＜0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0組高于 N+組，P＜0.01)和臨床分期(Ⅰ、Ⅱ期高于Ⅲ、Ⅳ期，P＜0.05)相關(guān)，與臨床分型及年齡分組無關(guān)(P＞0.05)。N-cadherin在喉癌組織中的mRNA相對表達(dá)量(0.70 ±0.21)高于癌旁組織(0.36 ±0.11)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);喉鱗癌中，N-cadherin的mRNA表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N+組高于 N0組，P＜0.05)、臨床分期(Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期，P ＜0.01)相關(guān)，與腫瘤病理學(xué)分級、臨床分型、年齡分組無關(guān)(P＞0.05)。

2.3 3種基因mRNA及蛋白表達(dá)相關(guān)性 在mRNA水平及蛋白水平，Twist與 E-cadherin(r=-0.760，P ＜0.01;r=-0.662，P ＜ 0.01)，N-cadherin 與 E-cadherin(r=-0.615，P ＜0.01;r=-0.558，P ＜0.01)的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān);Twist與N-cadherin均呈正相關(guān)(r=0.850，P ＜0.01;r=0.649，P ＜0.01)。

3 討論

Twist屬于螺-環(huán)-螺(basic helix-loop-helix，bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族，可調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞重建，并賦予細(xì)胞遷移的能力。2004年Yang等［4］在小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型中發(fā)現(xiàn)Twist的重要作用，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Twist與EMT現(xiàn)象及腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，從而引發(fā)了人們對于腫瘤中Twist作用的關(guān)注。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無論在mRNA還是在蛋白水平，Twist在喉癌組織的表達(dá)都比癌旁組織明顯升高，表明Twist可能參與喉癌的發(fā)生，其原因可能是Twist能夠抑制細(xì)胞凋亡。Twist通過抑制P53蛋白活性，影響P53介導(dǎo)的凋亡通路來抑制凋亡的機(jī)制已被證實(shí)［5］。另外，Twist還可通過對Akt途徑的正性調(diào)控作用抑制凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，以RNA干擾技術(shù)沉默Twist基因后可增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡。目前已在多種人類上皮來源腫瘤中發(fā)現(xiàn)Twist表達(dá)增高，并與患者預(yù)后關(guān)系密切，如子宮頸癌［6］、乳腺癌［7］等，而在喉癌組織中的研究國內(nèi)還少見相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)對Twist在喉癌組織中的mRNA和蛋白的表達(dá)和臨床各參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Twist的表達(dá)率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期組高于Ⅰ、Ⅱ期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Twist在喉癌的浸潤轉(zhuǎn)移過程中也起重要作用。這與Song等［8］關(guān)于Twist表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究結(jié)果一致。Yuen等［9］發(fā)現(xiàn)Twist胞核內(nèi)表達(dá)對原發(fā)前列腺癌轉(zhuǎn)移潛能的判斷有意義。我們在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)Twist在核表達(dá)呈強(qiáng)陽性的3例標(biāo)本中均伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示Twist在胞核內(nèi)表達(dá)增高也可能對喉癌轉(zhuǎn)移潛能的判斷有意義，但因本實(shí)驗(yàn)Twist在核表達(dá)為強(qiáng)陽性的樣本數(shù)較少，尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ou等［10］對50例頭頸部鱗癌組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，證實(shí)Twist陽性表達(dá)和腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及疾病進(jìn)展密切相關(guān)，但準(zhǔn)確的調(diào)節(jié)機(jī)制需進(jìn)一步研究。

E-cadherin及N-cadherin是鈣黏附分子家族中與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系最密切的2種，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雖然E-cadherin在喉癌和癌旁組織中均有表達(dá)，但E-cadherin在喉癌中不僅表達(dá)減少，且以胞質(zhì)表達(dá)為主，胞膜表達(dá)不明顯。這可能是因?yàn)榇藭r(shí)E-cadherin雖有合成，但不能良好表達(dá)于細(xì)胞膜，發(fā)揮應(yīng)有的黏附作用。對喉癌組織中E-cadherin的表達(dá)與喉癌臨床參數(shù)的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，無論mRNA還是蛋白的表達(dá)都與腫瘤病理學(xué)分級、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)，均提示E-cadherin表達(dá)下調(diào)或缺失參與了喉癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗(yàn)對N-cadherin表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，在蛋白和mRNA水平喉癌中都較癌旁組織升高，并與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)N-cadherin的蛋白表達(dá)與年齡相關(guān)，但mRNA與年齡無關(guān)，以往并無證據(jù)表明N-cadherin的蛋白表達(dá)與年齡相關(guān)，故推斷可能是由于統(tǒng)計(jì)中的抽樣誤差造成，該結(jié)論需進(jìn)一步驗(yàn)證。有研究顯示，N-cadherin在胞核或胞質(zhì)中高表達(dá)可引起癌基因c-erbB1的蛋白表達(dá)產(chǎn)物EGFR作用持續(xù)增強(qiáng)。當(dāng)EGF與之結(jié)合后可刺激細(xì)胞分裂和增殖，從而促進(jìn)某些腫瘤形成。N-cadherin的高表達(dá)還可以激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，誘導(dǎo)MMP-9基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管形成，使腫瘤易于生長和轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在mRNA和蛋白水平上都存在Twist和 E-cadherin負(fù)相關(guān)，Twist與 N-cadherin正相關(guān)，E-cadherin和N-cadherin負(fù)相關(guān)。Twist通過調(diào)控EMT來促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移已在乳腺癌［11］、甲狀旁腺癌［12］等多種腫瘤中被證實(shí)。EMT的特征是上皮性標(biāo)記丟失如 E-cadherin，而獲得間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記如N-cadherin，vimetin，smooth muscle actin。一些基因如Twist，snail，sip1，slug 等能夠誘導(dǎo) EMT，其共同特征是含有靶基因啟動子上的E-box基因序列的DNA結(jié)合序列。

但在Twist高表達(dá)的狗腎內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)入并表達(dá)E-cadherin并不能誘導(dǎo)EMT的逆轉(zhuǎn)［4］，說明Twist的作用機(jī)制絕非僅僅是抑制E-cadherin，可能涉及其他基因和細(xì)胞因子。Huber等［13］發(fā)現(xiàn) Twist既可直接與E-cadherin啟動子區(qū)的E-box結(jié)合，從轉(zhuǎn)錄水平上抑制E-cadherin的表達(dá)，又可通過非轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)使細(xì)胞黏著蛋白和纖連蛋白表達(dá)增高來增加腫瘤細(xì)胞侵襲力。在胚胎發(fā)育過程中，Twist能促進(jìn) N-cadherin的表達(dá)，N-cadherin的增加進(jìn)一步導(dǎo)致E-cadherin的表達(dá)下降;而N-cadherin在細(xì)胞間的連接作用要明顯低于E-cadherin，所以當(dāng)N-cadherin的表達(dá)增高后，腫瘤細(xì)胞的能力就會明顯提高。以上均提示Twist可能通過上調(diào)N-cadherin和下調(diào)E-cadherin介導(dǎo)EMT發(fā)生，從而參與喉癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移。3種基因的聯(lián)合檢測可較好反映腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，為指導(dǎo)臨床治療和腫瘤基因治療提供重要的臨床參考價(jià)值。

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