乳腺癌中乙醛脫氫酶1與上皮性鈣黏蛋白、神經(jīng)性鈣黏蛋白關(guān)系的研究

蔡建英，吳誠義

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乳腺癌中乙醛脫氫酶1與上皮性鈣黏蛋白、神經(jīng)性鈣黏蛋白關(guān)系的研究

蔡建英，吳誠義

400016 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌乳腺外科

乳腺癌干細(xì)胞是一類具有自我更新及多向分化潛能的原始細(xì)胞，在一定條件下可以分化成多種不同功能的細(xì)胞，從而影響乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥及復(fù)發(fā)等生物學(xué)行為[1]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。本實驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法研究乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物乙醛脫氫酶1（ALDH1）蛋白與 EMT 標(biāo)志蛋白上皮性鈣黏蛋白（E-cadherin）、神經(jīng)性鈣黏蛋白（N-cadherin）在正常乳腺組織、乳腺癌、轉(zhuǎn)移性淋巴組織中的表達(dá)情況，探討乳腺癌干細(xì)胞與乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣本

采集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 2010 年 9 月– 2011 年 12 月間行乳腺癌根治手術(shù)患者組織標(biāo)本 40 例，同時收取腫大腋窩淋巴結(jié) 28 例，年齡 33 ~ 73 歲，平均 51.2 歲。收取本院 2011 年 9 – 11 月間行良性乳腺病變微創(chuàng)手術(shù)切緣組織 30 例作為正常乳腺組織標(biāo)本。

1.2 主要試劑與儀器

ALDH1 兔抗人多克隆抗體購于美國Abcam 公司；兔抗人多克隆 E-cadherin 抗體及兔抗人多克隆 N-cadherin 抗體購于武漢博士德公司；SP 免疫組化染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒購于北京中杉金橋公司。2135 型輪轉(zhuǎn)式組織切片機(jī)為德國Leica 公司產(chǎn)品；BX50 光學(xué)顯微鏡和 TVL 顯微攝像系統(tǒng)均為日本 Olympus 公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 病理學(xué)檢查 所有標(biāo)本經(jīng) 4% 甲醛溶液固定至少 24 h，石蠟包埋，4 μm 厚切片。根據(jù)病理學(xué)檢測結(jié)果，將標(biāo)本分為正常組（n = 28），乳腺癌組（n = 40），淋巴轉(zhuǎn)移組（腋窩淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移，n = 26）。

1.3.2 免疫組化染色 采用免疫組化 SP 法染色。標(biāo)本切片行脫蠟、梯度酒精水化、熱抗原修復(fù)、血清封閉后，滴加一抗工作液（ALDH1 抗體工作液濃度為 1:100；E-cadherin 與 N-cadherin 抗體工作液濃度均為 1:50），4 ℃冰箱過夜，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，DAB 顯色，蘇木精輕度復(fù)染，中性樹脂封片。

1.3.3 結(jié)果判定 ALDH1 蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。根據(jù)染色強(qiáng)度及顯色細(xì)胞比例，對染色結(jié)果進(jìn)行分級。按切片中細(xì)胞有無顯色及顯色深淺進(jìn)行評分：無顯色為 0 分，淺棕色為 1 分，深棕色為 2 分。按顯色細(xì)胞比例進(jìn)行評分：0%~ 10%為 0 分，11%~ 30%為 1 分，31%~ 70%為 2 分，> 71% 為 3 分。以上述兩項評分之和作為每個患者的積分：0 分為陰性（–），l ~ 5 分為陽性（+）[2]。E-cadherin 表達(dá)采用半定量方法判斷，以細(xì)胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，結(jié)果判讀參照 Mahler-Araujo 等[3]的評分方法：陽性細(xì)胞 0% ~ < 10% 為 0 分，陽性細(xì)胞 10% ~ < 25% 為 1 分，陽性細(xì)胞 25% ~ < 50% 為 2 分，陽性細(xì)胞 50% ~ < 75% 為 3 分，陽性細(xì)胞≥ 75% 為 4 分，0 ~ 3 分為表達(dá)陰性，≥ 3 分為表達(dá)陽性。N-cadherin 表達(dá)采用半定量方法判斷，以細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，結(jié)果判讀參照Lascombe 等[4]的評分方法：≥ 5%為表達(dá)陽性，< 5%為表達(dá)陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS17.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料用2檢驗，以= 0.05 為檢驗水準(zhǔn)，以< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALDH1、E-cadherin、N-cadherin 在不同組織中的表達(dá)

ALDH1 表達(dá)于乳腺癌組織細(xì)胞質(zhì)中，在正常乳腺組織中不表達(dá)；在 28 例正常乳腺組織、40 例乳腺癌組織及26 例腋窩轉(zhuǎn)移淋巴組織分別表達(dá) 0 例（0.0%）、8 例（20.0%）、9 例（34.6%），其表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（= 0.004）。在正常乳腺組織中，E-cadherin 主要表達(dá)于細(xì)胞膜，呈棕黃色，少量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。隨著乳腺組織癌變及轉(zhuǎn)移發(fā)生，E-cadherin 逐漸降低，且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)；在 28 例正常乳腺組織、40 例乳腺癌組織及 26 例腋窩轉(zhuǎn)移淋巴組織分別表達(dá) 28 例（100.0%）、22 例（55.0%）、8 例（30.8%），其表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（= 0.000）。N-cadherin 主要表達(dá)于癌組織細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色，少量表達(dá)于細(xì)胞膜，在正常乳腺組織中不表達(dá)。隨著乳腺組織癌變及轉(zhuǎn)移，N-cadherin 表達(dá)逐漸上調(diào)，且出現(xiàn)細(xì)胞膜表達(dá)增強(qiáng)。在28 例正常乳腺組織、40 例乳腺癌組織及 26 例腋窩轉(zhuǎn)移淋巴組織中分別表達(dá) 0 例（0.0%）、19 例（47.5%）、19 例（73.1%），其表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（= 0.000）（表 1和圖 1）。

表 1 ALDH1、E-cadherin、N-cadherin 在不同組織中的表達(dá)

圖 1 免疫組織化學(xué)法檢測 ALDH1、E-cadherin、N-cadherin 在不同組織中的表達(dá)（× 400）（A：ALDH1 在正常乳腺組織中呈陰性表達(dá)；B：ALDH1 在乳腺癌組織中呈陽性表達(dá)；C：ALDH1 在腋窩轉(zhuǎn)移淋巴組織中呈陽性表達(dá)；D：E-cadherin 在正常乳腺組織中呈陽性表達(dá)；E：E-cadherin 在乳腺癌組織中呈陰性表達(dá)；F：E-cadherin 在腋窩轉(zhuǎn)移淋巴組織中呈陰性表達(dá)；G：N-cadherin 在正常乳腺組織中呈陰性表達(dá)；H：N-cadherin 在乳腺癌組織中呈陽性表達(dá)；I：N-cadherin 在腋窩轉(zhuǎn)移淋巴組織中呈陽性表達(dá)）

2.2 乳腺癌中 ALDH1 與 E-cadherin、N-cadherin 的關(guān)系

在 22 例 E-cadherin陽性表達(dá)乳腺癌中，ALDH1 陽性表達(dá) 1 例（4.5%），18 例E-cadherin陰性表達(dá)乳腺癌中 ALDH1陽性表達(dá) 7 例（38.9%），其表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（= 0.007）。在 19 例 N-cadherin陽性表達(dá)乳腺癌中，ALDH1陽性表達(dá) 7 例（36.8%），21 例 N-cadherin陰性表達(dá)乳腺癌中 ALDH1陽性表達(dá) 1 例（4.8%），其表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（= 0.011）（表 2）。

表 2 乳腺癌中 ALDH1 與 E-cadherin、N-cadherin表達(dá)的關(guān)系

3 討論

2003 年，AI-Hajj 等[5]最先證實了乳腺癌干細(xì)胞的存在。在乳腺癌患者轉(zhuǎn)移性胸腔積液中分離得到一類表型為 CD44+/CD24-/low 的乳腺癌細(xì)胞，此類細(xì)胞具有自我更新、多向分化潛能及強(qiáng)致瘤性等特征，符合腫瘤干細(xì)胞的特征。2007 年，Ginestier 等[6]通過成瘤實驗發(fā)現(xiàn) ALDH1 陽性乳腺癌細(xì)胞具有極強(qiáng)的成瘤能力，從而利用 ALDH1 在乳腺癌組織中分離鑒定出乳腺癌干細(xì)胞。ALDH1+及 CD44+/CD24-/low 表型是目前研究比較成熟的乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物。

乳腺癌干細(xì)胞是一群具有自我更新及多向分化潛能的原始細(xì)胞亞群，而浸潤及轉(zhuǎn)移亦是乳腺癌干細(xì)胞的特征之一。EMT 是指上皮細(xì)胞在正常生理和特定病理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)（分）化的現(xiàn)象，該上皮細(xì)胞失去極性，經(jīng)過細(xì)胞骨架重塑，轉(zhuǎn)變成具有遷移能力的間充質(zhì)表型的過程[7]，是腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。在此過程中癌細(xì)胞喪失上皮細(xì)胞特性并同時獲得間質(zhì)細(xì)胞的某些特性，游走能力及與周圍或遠(yuǎn)處間質(zhì)組織親和能力增強(qiáng)，從而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。E-cadherin 及 N-cadherin 的異常表達(dá)在 EMT 過程中起到了重要作用。E-cadherin 主要分布于胚胎組織和成熟組織的上皮細(xì)胞中，具有促進(jìn)細(xì)胞黏附聚集、保持上皮形態(tài)及結(jié)構(gòu)完整、參與細(xì)胞分化和細(xì)胞極性等重要作用。而 N-cadherin 僅表達(dá)于神經(jīng)外胚層和中胚層來源的組織，正常上皮組織不表達(dá)。N-cadherin 在上皮組織中的異位表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，而且其作用超過 E-cadherin 介導(dǎo)的細(xì)胞黏附作用。Wheelock 等[8]認(rèn)為在發(fā)生 EMT 過程中“鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換”（cadherin switch）也起到重要作用，即腫瘤細(xì)胞中 E-cadherin 表達(dá)下調(diào)，同時向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化；而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 N-cadherin 表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)上皮細(xì)胞與間質(zhì)黏附，使細(xì)胞獲得運動遷移能力。本研究中發(fā)現(xiàn)，正常乳腺組織-乳腺癌-癌轉(zhuǎn)移性淋巴組織中，E-cadherin 表達(dá)逐漸減少，而 N-cadherin 表達(dá)逐漸增加，且各組間表達(dá)有差異性（< 0.05）。

近年有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，EMT 過程可誘導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞 CD44+/CD24-/low 表型表達(dá)增加[9]。Mani 等[10]發(fā)現(xiàn)非腫瘤乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)歷 EMT 后，E-cadherin 表達(dá)下調(diào)而N-cadherin 上調(diào)，同時 CD44+/CD24-/low 表型細(xì)胞增多，因此，認(rèn)為 EMT 可以誘導(dǎo)乳腺癌產(chǎn)生具有CD44+/CD24-/low 表型的細(xì)胞。包俊杰和吳誠義[11]通過檢測正常乳腺組織、癌旁乳腺組織、乳腺癌組織及癌轉(zhuǎn)移性腋窩淋巴組織 E-cadherin、N-cadherin 及 CD44/CD24 的表達(dá)情況，亦認(rèn)為經(jīng)歷 EMT 過程后，CD44+/CD24-/low 表型表達(dá)增加。韓明利等[12]發(fā)現(xiàn) EMT 還可誘導(dǎo)乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞中 ALDH1 的表達(dá)增加。本研究結(jié)果顯示，正常乳腺組織、乳腺癌及轉(zhuǎn)移性淋巴幾種組織類型中，ALDH1 表達(dá)逐漸增加，E-cadherin 表達(dá)逐漸減少，N-cadherin 表達(dá)逐漸增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.05）。在乳腺癌組織中， ALDH1表達(dá)與 E-cadherin、N-cadherin 的表達(dá)存在相關(guān)性（< 0.05）。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn) EMT 過程中存在“鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換”過程，即：正常乳腺組織-乳腺癌-癌轉(zhuǎn)移性淋巴組織中，E-cadherin 表達(dá)逐漸減少，而 N-cadherin 表達(dá)逐漸增加。ALDH1 在 EMT 過程中表達(dá)逐漸增加，且與 E-cadherin 及 N-cadherin 表達(dá)存在相關(guān)性。EMT 過程是否會誘導(dǎo) ALDH1陽性表型乳腺癌干細(xì)胞表達(dá)增加尚需進(jìn)一步研究。

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吳誠義，Email：NFMWK1192@hospital-cqmu.com

2013-12-16

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.03.015