三氧化二砷聯(lián)合順鉑抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究

王志剛，鐘根深，馬鵬舉，岳雙柱，周國勝

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三氧化二砷聯(lián)合順鉑抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究

王志剛，鐘根深，馬鵬舉，岳雙柱，周國勝

453100 河南衛(wèi)輝，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科/河南省神經(jīng)病學(xué)研究所

探討三氧化二砷（As2O3）聯(lián)合順鉑（CDDP）抑制 C6 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖情況及其分子機(jī)制。

體外實(shí)驗(yàn)采用 MTT 法檢測(cè)對(duì) C6 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率，流式細(xì)胞法檢測(cè) C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡及周期，Western blot 檢測(cè) caspase-3、PTEN、PI3K、Akt 蛋白表達(dá)水平；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè) caspase-3、IκB-α 調(diào)控因子的表達(dá)，并觀察大鼠的生存情況。

As2O3、CDDP 及聯(lián)合應(yīng)用分別作用于 C6 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 24 h 后的細(xì)胞增殖最大抑制率分別為 34.37%、31.73% 和 76.40%，其相應(yīng)藥物濃度分別為 12.5、10.0、（12.5 + 10.0）μmol/L；兩者聯(lián)用后對(duì) C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用 24 h 后的凋亡率分別為從單獨(dú)用藥時(shí)的（4.60 ± 1.12）%、（14.59 ± 0.79）% 提高到（36.13 ± 1.55）%；采用 PI 單染檢測(cè)的細(xì)胞周期也進(jìn)一步證明了聯(lián)合用藥增加了 C6 細(xì)胞的周期抑制作用。Caspase-3、PTEN 蛋白在聯(lián)合組 C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，而 PI3K、Akt 蛋白在聯(lián)合組C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)；免疫組化法檢測(cè)結(jié)果顯示，caspase-3 調(diào)控因子在聯(lián)合組用藥的 C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，而IκB-α 調(diào)控因子表達(dá)下調(diào)；但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，在 18 d 觀察期內(nèi)各組大鼠的生存期無明顯差異（= 0.2531）。

As2O3聯(lián)合 CDDP 通過上調(diào) caspase-3 和 PTEN，下調(diào) PI3K、Akt 及IκB-α 抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞體內(nèi)外的生長(zhǎng)。

順鉑； 神經(jīng)膠質(zhì)瘤； 細(xì)胞凋亡； 三氧化二砷； 藥物療法，聯(lián)合

惡性腫瘤的術(shù)后化療可以阻滯腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲及擴(kuò)散，進(jìn)而提高患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)患者的生存期。近年來研究發(fā)現(xiàn)，As2O3不僅對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病有很好療效，而且對(duì)實(shí)體腫瘤，如胃癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌等也顯現(xiàn)了一定的抗腫瘤效果[1-5]。另有研究表明，As2O3與順鉑（CDDP）聯(lián)合應(yīng)用，在不增加 CDDP 對(duì)腎毒性作用情況下，還能提高 CDDP 的化療效果[6-7]。同時(shí)亦有研究發(fā)現(xiàn)，As2O3脂質(zhì)體可使更多的 As2O3通過血腦屏障，誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，并具有明顯的劑量-時(shí)間依賴性關(guān)系[8]。CDDP 在膠質(zhì)瘤的化療中應(yīng)用較為廣泛，本研究欲通過 As2O3與 CDDP 聯(lián)合應(yīng)用的體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，來探討臨床 As2O3與 CDDP 聯(lián)合應(yīng)用治療腦膠質(zhì)瘤的可行性及其可能的機(jī)制；并探討中西藥結(jié)合治療腦膠質(zhì)瘤的優(yōu)勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞由河南省神經(jīng)病學(xué)研究所提供，常規(guī)傳代培養(yǎng)；雌性SD 大鼠，體重 150 ~ 200 g，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)：SCXK（京）2013-0001，普通環(huán)境飼養(yǎng)。

1.1.2 主要藥物和試劑 As2O3、CDDP（20061001）為云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；caspase-3、IκB-α、PTEN、PI3K、Akt 單克隆抗體及 ABC 免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒及定影液、顯影液購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器 Multiskan MK3 酶標(biāo)儀由美國 Thermo Electron 公司生產(chǎn)；BM-IX 生物組織包埋機(jī)由孝感醫(yī)療器械公司生產(chǎn)；HI122 型烤片機(jī)由德國 Leica Microsystem Nussloch 公司生產(chǎn)；江灣I 型腦立體定向儀為第二軍醫(yī)大學(xué)生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以 5 × 103個(gè)/孔接種于 96 孔板中。分為 4 組：①對(duì)照組；②As2O3組；③CDDP 組；④As2O3+ CDDP 組。CDDP 濃度分別為 10、5、2.5 μmol/L，As2O3濃度為 12.5、6.25 和 3.125 μmol/L。對(duì)照組加入無藥物的 RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)液，終體積為 0.2 ml/孔。培養(yǎng) 24 h 后，加入 MTT（5 mg/ml）溶液 20 μl，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。取出后，將培養(yǎng)液丟棄，加入150 μl 二甲基亞砜，置水平搖床振蕩 20 min 后，酶標(biāo)儀上測(cè)定570。兩藥聯(lián)合指數(shù)（CI）根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]計(jì)算，公式為：

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期和凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以 5 × 104個(gè)/孔接種于 6 孔板中，分為 4 組：①對(duì)照組；②As2O3組（12.5 μmol/L）；③CDDP 組（10 μmol/L）；④As2O3+ CDDP[（12.5 + 10）μmol/L]聯(lián)用組。加入藥物后，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，收集各組細(xì)胞于 1.5 ml EP 管中，其中檢測(cè)細(xì)胞周期的細(xì)胞采用預(yù)冷的 70%乙醇固定，4 ℃碘化丙啶（PI）染色 30 min，過濾，以流式細(xì)胞儀及 ModFit 分析軟件檢測(cè)細(xì)胞周期；檢測(cè)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞不固定，采用 Annexin V/PI 雙染試劑盒，按試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞凋亡。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.2.3 Western blot 實(shí)驗(yàn) 按照 BCA 蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行蛋白提取。caspase-3、PTEN、PI3K 和 Akt 抗體使用時(shí)按照 1:500 進(jìn)行稀釋，同時(shí) 4 ℃孵育過夜。蛋白電泳（10% 的SDS- PAGE）進(jìn)行相關(guān)抗體的電泳實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 SD 大鼠 C6 膠質(zhì)瘤模型的建立 10% 水合氯醛（3.0 ml/kg）麻醉 SD 大鼠，固定在腦立體定向儀上，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，接種至大鼠右側(cè)尾狀核區(qū)（前囟中點(diǎn)旁 3 mm，冠狀縫前 1 mm），接種細(xì)胞數(shù)為 5 × 105個(gè)，共 15 μl，速度為 1 μl/min，注射完畢留針 5 min，緩慢拔針，骨蠟封閉骨孔，消毒，縫合皮膚[11-12]。

1.2.5 動(dòng)物分組治療及病理檢測(cè) 大鼠經(jīng) Gd-DTPA 強(qiáng)化 MRI 掃描檢測(cè)成瘤后，隨機(jī)分4 組，每組 10 只大鼠：①對(duì)照組，0.9%氯化鈉溶液腹腔注射 1 mg/kg；②As2O3組，腹腔注射 As2O31 mg/kg；③CDDP 組，腹腔注射 CDDP1 mg/kg；④As2O3+ CDDP 組，腹腔注射 CDDP 和 As2O3均為 1 mg/kg。連續(xù)給藥 7 d 后，每組處死 4 只大鼠，取出腦組織，切取含瘤灶部位 4 mm 厚組織，福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4 μm 厚連續(xù)切片，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.2.6 免疫組織化學(xué)分析 采用 ABC 免疫組織化學(xué)法，按照檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。200 倍視野下，隨機(jī)選取 10 個(gè)視野（high power field，hpf），計(jì)數(shù) 800 ~ 1000 個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞百分比（%/hpf）。IκB-α 陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒沉著；caspase-3 陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒沉著。

1.2.7 生存分析 根據(jù)剩余大鼠死亡情況，采用 Graphpad prism 5 軟件作 Kaplan-Meier 生存分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì) C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用

各實(shí)驗(yàn)組（不包括對(duì)照組）24 h 后對(duì) C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞均有抑制作用，且具有較明顯的劑量－時(shí)效關(guān)系，抑制作用隨著藥物濃度的提高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)；同時(shí)從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中能夠觀測(cè)到各濃度 As2O3與 CDDP 聯(lián)合用藥對(duì) C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制明顯增強(qiáng)（< 0.05）。如圖 1 所示，不同濃度聯(lián)合用藥時(shí)，CI 值分別為 0.59、0.67 和 0.95，說明 CDDP 和 As2O3在高、中濃度聯(lián)合用藥組對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率增加更為明顯，具有較好的協(xié)同作用。

抑制率（%）Inhibition rate (%)1009080706050403020100 CDDP 10 5 2.5 As2O3 12.5 6.25 3.125 藥物濃度（μmol/L）Drug concentration (μmol/L)

Figure 1 Inhibition efficiency of CDDP, As2O3and their combination on proliferation of glioma cell line C6 (*< 0.05)

2.2 對(duì) C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及周期的影響

通過 MTT 法我們測(cè)得CDDP、As2O3及聯(lián)合用藥對(duì) C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞抑制率最高的藥物濃度。根據(jù) CI 值，選擇 CDDP 10 μmol/L 和 As2O312.5 μmol/L 作為細(xì)胞凋亡和周期時(shí)的藥物濃度，作用于 C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞并測(cè)得其凋亡及周期曲線（圖2 和圖3）。

圖 2 不同藥物對(duì)C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

Figure 2 Effect of CDDP, As2O3and their combinationon apoptosis of glioma cell line C6

圖 3 不同藥物對(duì)C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響

Figure 3 Effect of CDDP, As2O3and their combinationon cell cycle distribution of glioma cell line C6

由圖 2 可知，采用 PI/Annexin V 雙染的方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明As2O3、CDDP 及聯(lián)合應(yīng)用對(duì) C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用 24 h 后的凋亡率分別從單獨(dú)用藥時(shí)的（4.60 ± 1.12）%、（14.59 ± 0.79）% 增加到（36.13 ± 1.55）%。聯(lián)用組能夠明顯促進(jìn) C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，與 CDDP 或者 As2O3單獨(dú)用藥相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）。在采用 PI 單染的情況下檢測(cè)細(xì)胞周期，由圖 3 可知，聯(lián)用組能夠顯著阻止 C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期停在 G2/S 期，導(dǎo)致亞 G1 峰的細(xì)胞碎片大量增加，說明聯(lián)合后能夠增強(qiáng)細(xì)胞增殖抑制的效果。

2.3 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，caspase-3、PTEN 蛋白在聯(lián)用組表達(dá)明顯上調(diào)，而 PI3K、Akt 蛋白在聯(lián)用組則表達(dá)量明顯下降（圖 4）。

對(duì)照組 As2O3 CDDP As2O3 +Control CDDPkD Pro-Caspase-3Caspase-3 PTEN PI3K Akt β-actin 321712 54 85 60 42

Figure 4 Effect of CDDP, As2O3and their combination on caspase-3, PTEN, PI3K, Akt protein expression in glioma cell line C6

2.4 免疫組化檢測(cè) IκB-α 在 C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了 IκB-α 的表達(dá)，以腫瘤細(xì)胞中見淡黃色至棕黃色者為陽性細(xì)胞，顯微鏡下觀察結(jié)果表明，IκB-α 在聯(lián)用組 C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯減少，且表達(dá)的 C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)目較少（圖 5）。

2.5 大鼠生活狀態(tài)觀察和生存分析

對(duì)照組大部分大鼠精神較差，飲食量明顯較其他各實(shí)驗(yàn)組差，活動(dòng)遲緩，行走旋轉(zhuǎn)，皮膚毛發(fā)紊亂潮濕，接種側(cè)眼球突出并見球結(jié)膜充血水腫，整體大鼠呈消瘦狀態(tài)，隨著時(shí)間的推移，在第 18 天時(shí)對(duì)照組大鼠全部死亡。As2O3及CDDP 組的大鼠生活情況較對(duì)照組稍好。聯(lián)合組用藥后的大鼠精神較用藥前明顯改善，飲食量尚可，四肢活動(dòng)無明顯旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，皮膚毛發(fā)清潔干燥，接種腫瘤側(cè)的眼球無明顯突出，未見球結(jié)膜充血水腫，體型正常，隨著時(shí)間的推移，大鼠死亡數(shù)量較對(duì)照組少。腫瘤接種后 1 周內(nèi)各組大鼠死亡數(shù)目相差不多，但隨著用藥后，各組之間大鼠死亡數(shù)有一定差異，在第 18 天時(shí)對(duì)照組全部死亡，CDDP 組和 As2O3組各還有 2 只存活，聯(lián)合組有 4 只存活。但在 18 d 的觀察期內(nèi)，雖然各組大鼠死亡數(shù)目不同，但 Kaplan-Meier 分析結(jié)果顯示，各組之間差異并不顯著（= 0.2531）（圖 6）。

IκB-α 陽性率（%/hpf）IκB-α positive ratio (%/hpf)0.04 0.03 0.02 0.01 0 對(duì)照組 As2O3 CDDP As2O3 +Control CDDPE

A：對(duì)照組；B：As2O3組；C：CDDP 組；D：As2O3+ CDDP 組；E：各組藥物作用膠質(zhì)瘤細(xì)胞后 IκB-α 表達(dá)的定量分析；**與對(duì)照組相比，< 0.05；△△與 As2O3和 CDDP 組相比，< 0.05。

A: Control group; B: As2O3group;C: CDDP group; D: As2O3+ CDDP group; E: Quantitative analysis of various drugson IκB-α expression in glioma cell;**Compared with control group,< 0.05;△△Compared with As2O3and CDDP group,< 0.05.

圖 5 免疫組化分析 CDDP 和As2O3對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 IκB-α 的表達(dá)影響（200 ×）

Figure 5 Effects ofCDDP and As2O3on IκB-α expression in glioma cell as determined byimmunohistochemical staining (200 ×)

存活率（%）Percent survival (%)100 80 60 40 20 0 5 10 15 20 時(shí)間（d）Time (d)

Figure 6 Various experimental group of rats survival curve

3 討論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見的惡性腫瘤，早期診斷困難，治愈率低，具有高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高死亡率的特點(diǎn)[13]。目前主要通過手術(shù)治療，并聯(lián)合化療、放療減少腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，但其治愈率仍較低，為此需尋找新的治療藥物。As2O3是中藥砒霜的主要成分，近些年來用于臨床治療急性早幼粒細(xì)胞白血病，同時(shí)對(duì)實(shí)體瘤也有明顯療效，但 As2O3的毒副作用較大，治療劑量和致死劑量很接近[14-15]。CDDP是臨床上常用的抗癌藥物，其療效呈劑量相關(guān)性，但大劑量可引起不可逆性腎功能損害及嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)，從而限制了臨床應(yīng)用[16-17]。任何抗癌藥單獨(dú)應(yīng)用，療效總是有限的，過分提高藥物劑量或藥物濃度，都會(huì)明顯地增加毒性，因此臨床上主張聯(lián)合用藥，以便提高療效、降低毒性、延緩或防止耐藥。

腫瘤的發(fā)生與正常細(xì)胞內(nèi)抑癌基因和癌基因的平衡失調(diào)有關(guān)。Caspase-3 是一種重要的細(xì)胞促凋亡因子，在正常細(xì)胞內(nèi)通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)而使細(xì)胞凋亡，也可通過水解蛋白質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞解體，最終形成凋亡小體[4]。在腫瘤治療過程中，caspase-3 蛋白表達(dá)上調(diào)，或者說 pro-caspase-3 切割的增加，常意味著細(xì)胞凋亡的增加。PTEN 基因是膠質(zhì)瘤的抑癌基因，PTEN 蛋白的正常表達(dá)可抑制腫瘤的發(fā)生。在人腦膠質(zhì)瘤中，PTEN 基因常發(fā)生突變或缺失，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[18]。相關(guān)研究表明，As2O3與CDDP 聯(lián)合應(yīng)用在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。主要機(jī)制為阻滯細(xì)胞周期[19]、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[20-21]及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化。本研究結(jié)果顯示，As2O3與 CDDP 聯(lián)合應(yīng)用可上調(diào) C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中 caspase-3 和 PTEN 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo) C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。PI3K-Akt 信號(hào)通路可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活[22]。其主要機(jī)制是 PI3K 可使 Akt 活化，而活化的 Akt 通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白 caspase3、IκB-α、p27 等，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等。PI3K-Akt 信號(hào)通路的活性可以被類脂磷酸酶 PTEN 負(fù)調(diào)節(jié)[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組中 PI3K/Akt 蛋白表達(dá)顯著，而聯(lián)合用藥組 PI3K/Akt 蛋白表達(dá)減低，說明 As2O3與 CDDP 聯(lián)合應(yīng)用可破壞 PI3K-Akt 信號(hào)通路導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡的增加，也可能是 As2O3與 CDDP 聯(lián)合應(yīng)用上調(diào) PTEN 蛋白的表達(dá)而起到負(fù)性調(diào)節(jié) PI3K-Akt 信號(hào)通路的作用，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。IκB-α 與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系密切，還能調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡和免疫活性[24-25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，As2O3與 CDDP 聯(lián)合應(yīng)用可使 IκB-α 的表達(dá)減少。IκB-α 表達(dá)下調(diào)，常意味著 NF-κB p65 亞基的釋放，導(dǎo)致 p65 蛋白轉(zhuǎn)移入核，誘導(dǎo)相關(guān)抗凋亡基因的表達(dá)，從而對(duì)抗 As2O3與 CDDP 誘導(dǎo)的凋亡作用。因此，在 As2O3與 CDDP 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中，IκB-α 在其中所扮演的作用可能是多方面的，其作用機(jī)制可能還需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)可得出以下結(jié)論：①As2O3、CDDP 對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞有一定抑制作用，尤其是兩者聯(lián)合使用效果更加明顯；②As2O3與 CDDP 聯(lián)合使用可通過提高 caspase3、PTEN 的表達(dá)，抑制或降低 IκB-α、PI3K/Akt 的表達(dá)來調(diào)節(jié)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及周期阻滯。因此，As2O3與 CDDP 聯(lián)合使用可影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。

雖然本實(shí)驗(yàn)體外結(jié)果證明了 As2O3與 CDDP 聯(lián)合可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，抑制其生長(zhǎng)，阻滯其細(xì)胞周期的循環(huán)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明可提高大鼠的存活率，但本實(shí)驗(yàn)因觀察時(shí)間有限（僅 18 d），實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明兩者聯(lián)用并不能有效地延長(zhǎng)大鼠的生存期，這也指導(dǎo)我們?cè)谂R床化療過程中，如遇到膠質(zhì)瘤晚期患者，在可預(yù)測(cè)的生存期有限的情況下，如何合理選擇兩藥聯(lián)用，需要仔細(xì)斟酌，以便獲得最佳的臨床療效，讓患者最大獲益。

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Effect of arsenic trioxide in combination with cisplatin on the proliferation of glioma C6 cells

WANG Zhi-gang, ZHONG Gen-shen, MA Peng-ju, YUE Shuang-zhu, ZHOU Guo-sheng

To investigate the effects of arsenic trioxide in combination with cisplatin on the proliferation of glioma cells C6.

In theexperiment, the proliferation inhibition of glioma cell line C6 was assessed by MTT assay, and the cell cycle distribution and apoptosis ratio of the cells were detected by flow cytometry. The expression levels of caspase-3, PTEN, PI3K and Akt were examined by Western blot. In theexperiment, the expression levels of caspase-3 and IκB-α were measured by immunohistochemical methods, and the rats’ life span was observed.

At the dosage of 12.5 μmol/L of As2O3and 10.0 μmol/L of CDDP, the proliferation inhibitory ratios of As2O3, CDDP and co-treatment group on glioma cell line C6 after 24 hours were 34.37%, 31.73% and 76.40%, respectively. Correspondingly, the apoptosis ratios after 24 hours were (4.60 ± 1.12)%, (14.59 ± 0.79)% and (36.13 ± 1.55)% respectively. Apoptosis induction was also proved by FACS using PI-stained method. The expression levels of caspase-3 and PTEN were up-regulated, while the expression levels of PI3K and Akt were down-regulated in the co-treatment group. Forexperiment, the expression of caspase-3 was up-regulated and IκB-α was down-regulated in the co-treatment group. However, the rats’ survival rate in different treatment groups was similar in the limited observation time (= 0.2531).

As2O3combined with CDDP has potent inhibitory action on glioma cells proliferation through up-regulating caspase-3 and PTEN and down-regulating PI3K, Akt and IκB-α expression levels.

Cisplatin; Glioma cell; Apoptosis; Arsenic trioxide; Drug therapy, combination

ZHOU Guo-sheng, Email: 745772199@qq.com; ZHONG Gen-shen, Email: genshenzhong@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.03.002

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（81201765）；河南省衛(wèi)生科技創(chuàng)新型人才工程（4160）

周國勝，Email：745772199@qq.com；鐘根深，Email：genshenzhong@163.com

2013-12-31

Author Affiliation: The Institute of Neurology, Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, 453100 Henan Weihui, China