同一組織來源的肝癌干細(xì)胞分化能力異質(zhì)性的體外研究

劉虹麟，許世清，彭亮，王在，房青，婁晉寧，秦蕾，王培剛，張文健

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同一組織來源的肝癌干細(xì)胞分化能力異質(zhì)性的體外研究

劉虹麟，許世清，彭亮，王在，房青，婁晉寧，秦蕾，王培剛，張文健

100029 北京，中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所（劉虹麟、許世清、彭亮、王在、房青、婁晉寧、張文?。胀饪疲ㄇ乩伲?；100101 北京，中國科學(xué)院生物物理所蛋白質(zhì)與多肽重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（王培剛）

通過比較肝癌干細(xì)胞的不同單細(xì)胞克隆的體外分化能力，分析同一組織來源的腫瘤干細(xì)胞分化能力是否具有異質(zhì)性，以進(jìn)一步明確腫瘤干細(xì)胞的分化特性，為靶向腫瘤干細(xì)胞的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

通過有限稀釋法對(duì)肝癌干細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞克隆培養(yǎng)，獲得的單細(xì)胞克隆通過 MTT 測(cè)定比較其增殖能力。然后分別挑選增殖速度較快和較慢的 3 個(gè)克隆，采用 RT-PCR 方法比較其干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平。對(duì)干細(xì)胞標(biāo)志表達(dá)水平高的 3 個(gè)克隆（A2、A3 和 B2）進(jìn)行向成骨、軟骨和脂肪方向的誘導(dǎo)分化。采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法檢測(cè)誘導(dǎo)前后成骨、軟骨和脂肪標(biāo)志分子的表達(dá)。

獲得的 20 個(gè)單細(xì)胞克隆增殖能力不同，并且增殖能力快的克隆表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物 CD133、Oct4、c-kit、SCF、nestin 比增殖能力慢的克隆強(qiáng)。向成骨方向誘導(dǎo)后，A2、A3 和 B2 克隆I型膠原 mRNA 表達(dá)水平分別升高了（4.71 ± 0.11）、（2.13 ± 0.15）和（3.82 ± 0.3）倍；骨鈣素 mRNA 的表達(dá)水平分別升高（8.55 ± 0.18）、（7.02 ± 0.03）和（7.91 ± 0.09）倍，說明 A2 克隆向成骨細(xì)胞分化能力最強(qiáng)。向軟骨方向誘導(dǎo)后，B2 分化能力最強(qiáng)，軟骨標(biāo)志分子蛋白聚糖和II型膠原的表達(dá)分別上調(diào)（25.01 ± 0.19）倍和（17.49 ± 0.19）倍，而在 A2 未發(fā)生明顯變化，A3 只輕微上調(diào)。向脂肪方向誘導(dǎo)后，A2、A3 和 B2 克隆脂聯(lián)素 mRNA 表達(dá)水平分別升高了（6.12 ± 0.15）、（11.45 ± 0.36）和（12.41 ± 1.03）倍，過氧化物酶體增殖物激活受體 γ mRNA 的表達(dá)水平分別升高（4.92 ± 0.02）、（9.54 ± 0.18）和（8.96 ± 0.11）倍。

來源于同一組織的肝癌干細(xì)胞在分化能力上具有異質(zhì)性，這可能是導(dǎo)致腫瘤組織異質(zhì)性的原因之一，也提示靶向腫瘤干細(xì)胞的治療需要聯(lián)合用藥。

腫瘤干細(xì)胞； 單細(xì)胞克??； 細(xì)胞分化； 異質(zhì)性； 間質(zhì)細(xì)胞

對(duì)放化療不敏感是惡性腫瘤臨床治療的重要難題，而腫瘤的異質(zhì)性是導(dǎo)致療效差的重要原因之一。近年來的研究認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）不僅是導(dǎo)致腫瘤異質(zhì)性的根源，而且其本身對(duì)化療極為不敏感，是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的關(guān)鍵因素。如何殺滅或減少 CSCs 已成為腫瘤治療中不可忽視的重要問題。近年來，利用 CSCs 具有分化能力的特點(diǎn)，通過誘導(dǎo) CSCs 分化可以促進(jìn)其對(duì)化療藥物的敏感性[1]，并減少 CSCs 的數(shù)量以改善療效[2]。

對(duì) CSCs 的分化特性進(jìn)行深入研究是建立以 CSCs 分化為目標(biāo)的治療手段所必需的。目前對(duì)各種組織來源 CSCs 的表型和自我更新及起始腫瘤能力的研究較多，但對(duì) CSCs 分化能力的研究相對(duì)薄弱。CSCs 具有非常復(fù)雜的生物學(xué)特性，甚至來源于同一組織的腫瘤干細(xì)胞群也存在表型差異[3]。但對(duì)同一腫瘤組織中的 CSCs 在分化能力上是否具有異質(zhì)性還不清楚。向間充質(zhì)分化是 CSCs 分化能力的重要體現(xiàn)，本研究對(duì)同一組織來源 CSCs 的單細(xì)胞克隆進(jìn)行間充質(zhì)分化能力的比較，分析 CSCs 是否具有分化異質(zhì)性。為闡明 CSCs 的分化特性和建立促進(jìn) CSCs 分化的治療措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM/F12 培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國 Gibco 公司；堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）、白血病抑制因子（leukimia inhibitor factor，LIF）和 B27 購自美國 Invitrogen 公司；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素 C、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、吲哚美辛購自美國 Sigma公司；RNA 提取試劑盒購自德國 Qiagen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國 Promega 公司；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 試劑盒和 SYBR Premix EX Taq 購自日本 Takara 公司；TSE100 型倒置相差顯微鏡購自日本 Nikon 公司；Multiskan MK3 型酶標(biāo)儀購自美國 Thermo 公司；ChemiDocTMXRS+ 型凝膠成像系統(tǒng)購自美國 Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 肝癌干細(xì)胞的來源和單細(xì)胞克隆培養(yǎng) 我們前期工作中從人原發(fā)性肝癌組織獲得 CSCs，該細(xì)胞表達(dá)多種干細(xì)胞的標(biāo)志性分子，并且具有很強(qiáng)的自我更新能力和成瘤能力[4]。

為更好地研究該 CSCs 的生物學(xué)特性，我們通過有限稀釋法將其進(jìn)行單克隆培養(yǎng)。細(xì)胞按照0.5 個(gè)/孔的濃度，200 μl/孔的終體積接種到 96 孔板，共接種 5 塊。使用干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，其配方為 DMEM/F12 1:1 培養(yǎng)基添加1% 胎牛血清、B27（1:50）、EGF（20 μg/L）、bFGF（10 μg/L）、LIF（10 μg/L）、2 mmol/L 谷氨酰胺、5 mg/L 胰島素和 0.5 mg/L 氫化可的松。待細(xì)胞貼壁后挑選只有一個(gè)細(xì)胞的孔，作好標(biāo)記。每 3 天換一次液，待細(xì)胞長至 90% 匯合時(shí)，將其一對(duì)一傳至 24 孔板擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.2 MTT 法比較各克隆的增殖能力 將最終獲得的單細(xì)胞克隆按照 500 個(gè)/孔的密度分別接種于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜后記為 0 d。用 MTT 法分別測(cè)定 0、1、3、5、7 d 的細(xì)胞增殖情況，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置 3 個(gè)平行孔。測(cè)定時(shí)每孔加入 0.5 g/L MTT 50 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，然后完全吸棄培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜 150 μl，輕輕振蕩使細(xì)胞內(nèi)的結(jié)晶紫完全溶解，在酶標(biāo)儀波長 492 nm 處測(cè)光密度值（值）。

1.2.3 RT-PCR 檢測(cè) CSCs 克隆的干細(xì)胞標(biāo)志物 經(jīng) MTT 測(cè)定挑選增殖能力最快的 3 個(gè)克隆和最慢的 3 個(gè)克隆，比較其干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)按照以下方法重復(fù)一次。收集每個(gè)克隆細(xì)胞約 1 × 106個(gè)，使用總 RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞總 RNA，取 1 μg 總 RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后采用 PCR 的方法分別擴(kuò)增 CD133、Oct4、干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）、c-kit 和 nestin。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 2% 瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.4 CSCs 克隆的間充質(zhì)分化 挑選增殖快、干細(xì)胞標(biāo)志表達(dá)水平高的 3 個(gè)克隆進(jìn)行分化特性的比較，每種分化方向重復(fù) 3次，具體方法如下：

1.2.4.1 向成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 將各克隆的細(xì)胞培養(yǎng)在成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其成分為 DMEM培養(yǎng)基添加10% FBS，以及終濃度為 0.1 μmol/L 的地塞米松、50 μmol/L 抗壞血酸和 10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，每 3 天更換一次培養(yǎng)基。誘導(dǎo)分化 21 d 后應(yīng)用 qPCR 方法檢測(cè)成骨細(xì)胞標(biāo)志物I型膠原（collagen type I）和骨鈣素的表達(dá)。以干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時(shí)間的細(xì)胞作為對(duì)照。

1.2.4.2 向軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 將各克隆的細(xì)胞培養(yǎng)在軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其成分為 DMEM培養(yǎng)基添加 10% FBS，以及終濃度為 10 μg/L 的轉(zhuǎn)化生長因子 β1，1 μg/L 的 bFGF 和 6.25 mg/L 的胰島素，每 3 天更換一次培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)分化 21 d 后應(yīng)用 qPCR 方法檢測(cè)軟骨細(xì)胞標(biāo)志物蛋白聚糖和II型膠原的表達(dá)。以干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時(shí)間的細(xì)胞作為對(duì)照。

1.2.4.3 向脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 將各克隆的細(xì)胞培養(yǎng)至 90% 匯合，換成脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基：DMEM 添加 1 μmol/L的地塞米松、0.5 mmol/L 的 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、2 μmol/L 的胰島素、200 mmol/L 的吲哚美辛誘導(dǎo)培養(yǎng) 3 d，再用含2 μmol/L 的胰島素、10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)1 d，循環(huán) 3 次后，用含 2 μmol/L 的胰島素、10% FBS 的 DMEM 繼續(xù)培養(yǎng) 8 d，每 3 天換液 1 次。誘導(dǎo)分化結(jié)束后應(yīng)用 qPCR 方法檢測(cè)脂肪細(xì)胞標(biāo)志物脂聯(lián)素和過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ）的表達(dá)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 細(xì)胞總 RNA 的提取和逆轉(zhuǎn)錄同 RT-PCR，使用 SYBR Green PCR 試劑盒，兩步法進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。引物序列見表 1。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行融解曲線分析，用計(jì)算 2-ΔΔCt的方法進(jìn)行半定量分析，通過比較各分化方向上分化標(biāo)志物的表達(dá)水平評(píng)價(jià)各克隆的分化能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表 1 人間充質(zhì)分化相關(guān)基因的引物序列

2 結(jié)果

2.1 CSCs 的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)

利用有限稀釋法在 96 孔板上挑選出只有 1 個(gè)細(xì)胞的克隆，有些克隆在培養(yǎng)過程中增殖緩慢甚至停止，因此無法擴(kuò)增培養(yǎng)。其他增殖較好的單細(xì)胞克隆最后擴(kuò)增至 T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶并凍存，共獲得 20 個(gè)克隆。

2.2 單細(xì)胞克隆增殖能力的比較

通過 MTT 測(cè)定法對(duì) 20 個(gè)克隆增殖能力進(jìn)行了比較，結(jié)果如圖 1 所示，各克隆增殖能力不同，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長差別更明顯，最快的和最慢的克隆在第 7 天值相差超過 1 倍。

OD4922.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0A1A2A3B1B2C1C2C3D1D2E1E2F1F2G1G2H1H2I1I2 1 3 5 7 時(shí)間（d）Time (d)

Figure 1 Evaluation of proliferation of CSCs clones by MTT assay

2.3 單細(xì)胞克隆的表型分析

為判斷得到的 20 個(gè)克隆是否均為 CSCs，我們挑選了 3 個(gè)增殖快的和 3 個(gè)增殖慢的克隆進(jìn)行干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平的比較。結(jié)果如圖 2 所示：CD133、Oct4、c-kit、SCF 和 nestin 的表達(dá)水平在 3 個(gè)增殖快的克隆上均明顯高于 3 個(gè)慢克隆。尤其以 CD133 和Oct4 最為明顯。說明增殖能力強(qiáng)的克隆保持干性好，而增殖能力弱的克隆可能發(fā)生了向祖細(xì)胞的分化。因此后續(xù)分化實(shí)驗(yàn)選擇增殖快的克隆進(jìn)行。

A2 A2 B2 I1 I2 H1 actin CD133 Oct4 c-kit SCF nestinA

Figure 2 Comparison of stem cell markers expression in CSCs clones by RT-PCR (A: Electrophoresis photo; B: Semi-quantity of line density)

2.4 單細(xì)胞克隆向成骨細(xì)胞分化能力的比較

將增殖快的 3 個(gè)克隆誘導(dǎo) 3 周后，A2、A3 和 B2 克隆I型膠原 mRNA 表達(dá)水平分別升高了（4.71 ± 0.11）、（2.13 ± 0.15）、（3.82 ± 0.3）倍，骨鈣素 mRNA 的表達(dá)水平分別升高（8.55 ± 0.18）、（7.02 ± 0.03）、（7.91 ± 0.09）倍（圖 3）。由此可見，A2 克隆向成骨細(xì)胞的分化更強(qiáng)，而 A3 克隆向成骨細(xì)胞分化的能力略弱于其他 2 個(gè)克隆。

2.5 單細(xì)胞克隆向軟骨細(xì)胞分化能力的比較

誘導(dǎo) 3 周后，A2、A3 和 B2 克隆軟骨蛋白聚糖 mRNA 表達(dá)水平分別升高了（1.4 ± 0.06）、（2.05 ± 0.08）、（25.01 ± 0.19）倍，II型膠原 mRNA 的表達(dá)水平分別升高（1.36 ± 0.02）、（2.02 ± 0.05）、（17.49 ± 0.19）倍（圖 4）。A2 克隆的軟骨標(biāo)志分子表達(dá)水平與對(duì)照無差別，A3 克隆的輕微上調(diào)，只有 B2 克隆誘導(dǎo)后兩種標(biāo)志蛋白表達(dá)水平升高均非常顯著（< 0.001）。由此可見，B2 克隆向軟骨細(xì)胞的分化能力明顯強(qiáng)于 A2 和 A3 克隆。

相對(duì) mRNA 水平Relative mRNA level10 8 6 4 2 0 A2A2 誘導(dǎo)后A2-inducedA3A3 誘導(dǎo)后A3-inducedB2B2 誘導(dǎo)后B2-induced I 型膠原 骨鈣素 Collagen I Osteocalcin

Figure 3 Comparison of osteogenic differentiation potential of CSCs single cell clones

相對(duì) mRNA 水平Relative mRNA level30 25 25 15 10 5 0A2A2 誘導(dǎo)后A2-inducedA3A3 誘導(dǎo)后A3-inducedB2B2 誘導(dǎo)后B2-induced 蛋白聚糖 II 型膠原 Aggrecan Collagen II

Figure 4 Comparison of chondrogenic differentiation potential of CSCs single cell clones

2.6 單細(xì)胞克隆向脂肪細(xì)胞分化能力的比較

誘導(dǎo) 3 周后，A2、A3 和 B2 克隆脂聯(lián)素mRNA 表達(dá)水平分別升高了（6.12 ± 0.15）、（11.45 ± 0.36）、（12.41 ± 1.03）倍，PPARγ mRNA 的表達(dá)水平分別升高了（4.92 ± 0.02）、（9.54 ± 0.18）、（8.96 ± 0.11）倍。3 個(gè)克隆誘導(dǎo)后脂聯(lián)素和 PPARγ 的表達(dá)均顯著升高（均< 0.01）（圖 5）。但從表達(dá)水平升高程度上，A3 和 B2 克隆明顯強(qiáng)于 A2 克隆。

相對(duì) mRNA 水平Relative mRNA level16 14 12 10 8 6 4 2 0A2A2 誘導(dǎo)后A2-inducedA3A3 誘導(dǎo)后A3-inducedB2B2 誘導(dǎo)后B2-induced 脂聯(lián)素 PPAPγ Adiponectin

Figure 5 Comparison of adipogenic differentiation potential of CSCs single cell clones

3 討論

目前的抗癌治療主要靶向已分化的增殖力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞，這對(duì)未分化的尤其是處于靜息期的CSCs 療效甚微。多種證據(jù)表明 CSCs 對(duì)化療、放療和免疫治療均很耐受[5-7]，甚至有時(shí)治療后反而導(dǎo)致 CSCs 的富集[8]。對(duì) CSCs 分化特性進(jìn)行深入研究以誘導(dǎo) CSCs 分化可能是解決其對(duì)治療不敏感的有效手段。

在肝癌 CSCs 的研究中，常使用表面標(biāo)志物 CD133[9]和 CD90[10]進(jìn)行 CSCs 的分選。但以一種或兩種表面標(biāo)志物所分選獲得的細(xì)胞在其他表型和功能上并不一定完全一致。為避免細(xì)胞異質(zhì)性帶來的實(shí)驗(yàn)誤差，本研究對(duì)CSCs 分化能力進(jìn)行分析之前，將獲得的肝癌干細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞克隆培養(yǎng)，這些來源于單細(xì)胞的 CSCs 亞群保證了細(xì)胞的均質(zhì)性，在進(jìn)行 CSCs 分化能力的研究中排除了細(xì)胞異質(zhì)性導(dǎo)致不同分化結(jié)果的可能。

我們對(duì)獲得的單細(xì)胞克隆首先進(jìn)行了增殖能力的比較，發(fā)現(xiàn)其增殖速度存在明顯差異。由于 CSCs 休眠時(shí)表現(xiàn)緩慢增殖特點(diǎn)，但激活后表現(xiàn)高增殖速度，因此我們分別挑選 3 個(gè)增殖最快的和 3 個(gè)增殖最慢的克隆進(jìn)行干性標(biāo)志分子的檢測(cè)。結(jié)果顯示增殖快的克隆表達(dá)干性標(biāo)志更強(qiáng)，這可能由于體外培養(yǎng)時(shí)添加的大量促增殖的生長因子導(dǎo)致 CSCs 激活進(jìn)入快速增殖周期。

向間充質(zhì)分化的能力用于鑒定多種組織來源 CSCs 的多向分化潛能，可代表 CSCs 的分化能力。本研究中 3 個(gè)快增殖克隆的間充質(zhì)分化能力存在明顯差異，在向成骨、軟骨和脂肪方向分化各有優(yōu)勢(shì)方向，說明同一肝癌組織來源的 CSCs 存在明顯的分化能力異質(zhì)性。此前，Abelson 等[11]對(duì)卵巢透明細(xì)胞癌的多個(gè)單細(xì)胞克隆進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)同一組織來源的 CSCs 在不同微環(huán)境中分化能力不同，說明同一癌組織中處于不同干細(xì)胞龕的 CSCs 表現(xiàn)不同的分化潛能。該研究說明外因?qū)е峦唤M織中 CSCs 分化能力不同，而本研究證實(shí)存在某些內(nèi)因?qū)е?CSCs 分化能力差異。

綜上所述，本研究結(jié)果表明：同一肝癌組織來源的腫瘤干細(xì)胞在分化能力上具有異質(zhì)性。由此推測(cè)，這種分化能力的異質(zhì)性可能是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性的原因之一，也提示在靶向CSCs 分化治療時(shí)需要采用聯(lián)合治療手段才能達(dá)到良好效果。

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Differentiation heterogeneity of liver cancer stem cells derived from the same cancer tissue

LIU Hong-lin, XU Shi-qing, PENG Liang, WANG Zai, FANG Qing, LOU Jin-ning, QIN Lei, WANG Pei-gang, ZHANG Wen-jian

To investigate the differentiation heterogeneity of cancer stem cells (CSCs) by comparing differentiation potential of clonally expanded subpopulations derived from the same cancer tissue.

Single cell clones ofCSCs were obtained by limited dilution method. The proliferation of these clones was evaluated by MTT assay. The expression of stem cell markers was detected by RT-PCR. Three clones (A2, A3 and B2) were induced to differentiate toward mesenchymal-like cell for 3 weeks. Real-time PCR was used to detect the mRNA levels of mesenchymal-specific markers.

The proliferation of the obtained 20 clones was differed between each other, and the expression of stem cell markers CD133, Oct4, c-kit, stem cell factor and nestin was higher in highly proliferation of clones than in the low proliferation of ones. Upon induction toward osteoblast, the mRNA level of collagen type I in clone A2, A3 and B2 was up-regulated to (4.71 ± 0.11),(2.13 ± 0.15) and (3.82 ± 0.3) times respectively; and the mRNA level of osteocalcin was up-regulated to (8.55 ± 0.18), (7.02 ± 0.03) and (7.91 ± 0.09) times respectively, which showed that A2 has stronger potential toward osteoblast. Upon induction toward chondrocyte, clone B2 exhibited very strong differentiation potential as shown the mRNA level of aggrecan and collagen type II was up-regulated to (25.01 ± 0.19) and (17.49 ± 0.19) times. However, the expression of aggrecan and collagen type II was not increased in clone A2 and increased slightly in clone A3. Upon induction toward adipocyte, the mRNA level of adiponectin in clone A2, A3 and B2 was up-regulated to (6.12 ± 0.15), (11.45 ± 0.36) and (12.41 ± 1.03) times respectively; and the mRNA level of peroxisome proliferator-activated receptor (PPARγ) was up-regulated to (4.92 ± 0.02), (9.54 ± 0.18) and (8.96 ± 0.11) times respectively, which suggested that A3 and B2 had stronger differentiation potential toward adipocyte.

The CSCs derived from the same cancer tissue has heterogeneity in differentiation potential, which may be one reason of tumor heterogeneity. These results indicate that combination of drugs might be needed in targeting CSCs treatment in the future.

Tumor stem cells; Single cell clone; Cell differentiation; Heterogeneity; Mesenchymal stem cells

WANG Pei-gang, Email: peigangwang@gmail.com; ZHANG Wen-jian, Email: zwj-72@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.03.001

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973 計(jì)劃）（2009CB521804）；國家自然科學(xué)基金（81370873、81302334）

王培剛，Email：peigangwang@gmail.com；張文健，Email：zwj-72@163.com

2014-02-19

Author Affiliations:Institute of Clinical Medical Sciences (LIU Hong-lin, XU Shi-qing, PENG Liang, WANG Zai, FANG Qing, LOU Jin-ning, ZHANG Wen-jian), Department of Surgery (QIN Lei), China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China; Key Laboratory of Proteins and Peptide Pharmaceuticals, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Science, Beijing 100101, China (WANG Pei-gang)