HPV16 E6通過阻礙ING4對(duì)p53作用而抑制細(xì)胞凋亡的研究

郭 毅，趙 楠，李天人，李 慧

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110001)

宮頸癌在世界范圍內(nèi)居女性腫瘤發(fā)病率的第二位，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的最重要致病因子，HPV16的E6和E7是宿主細(xì)胞永生化轉(zhuǎn)變的主要致癌蛋白［1］。HPV16 E6通過與一系列細(xì)胞因子的結(jié)合調(diào)控細(xì)胞的分化、黏連、極化、增殖、凋亡、基因轉(zhuǎn)錄和染色體的穩(wěn)定。HPV16 E6與這些細(xì)胞因子的作用對(duì)細(xì)胞的癌變及病毒本身的存活都至關(guān)重要。ING4是第二類腫瘤生長(zhǎng)抑制因子家族中的一員［2］。許多人體腫瘤都有ING家族蛋白的功能失調(diào)［3-4］，我們之前報(bào)道了HPV通過阻礙ING4與p53蛋白的結(jié)合而抑制細(xì)胞凋亡［5］，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明了該作用機(jī)制，并表明HPV16 E6抑制ING4誘導(dǎo)的p53蛋白第382位氨基酸的乙?；种萍?xì)胞凋亡，且該作用不依賴p53蛋白的降解。

1 材料與方法

1.1 材料

用于轉(zhuǎn)染的Flag標(biāo)記的HPV16 E6質(zhì)粒以HPV16 PCDNA3-E6 cDNAs為模板，PCR擴(kuò)增后經(jīng)HindIII和XbaI雙酶切后插入于HindIII和XbaI位點(diǎn)插入 pA3F 載體(Sigma，St Louis，MO)。Flag-E6 L50G是不與E6相關(guān)蛋白(E6AP)相結(jié)合并不引起p53蛋白降解的突變體，是由定點(diǎn)突變獲得(QuikChange;Stratagene)［6］。 pCDNA-ING4 及Myc-p53如前所述［4］，所有質(zhì)粒均經(jīng)測(cè)序證實(shí)?？笽NG4兔多抗和抗HPV16 E6(C1P5)的鼠單抗購于 Santa Cruz公司(Santa Cruz，CA);抗 flag(M2)的鼠單抗購于Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO);抗Myc(9E10)的鼠單抗購于Abcam公司(Cambridge，MA);鼠抗p53單抗 DO-1購自 Santa Cruz生物技術(shù)公司(Santa Cruz，CA);Saos-2(p53－/－)為p53陰性的骨肉瘤細(xì)胞系。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)染、免疫蛋白共沉淀和免疫蛋白印跡(Western blot)雜交 采用Bio-Rad Gene Pulser II型電穿孔儀將 Flag-E6、Myc-p53和 PCDNA-ING4三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Saos2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，RIPA緩沖液裂解。離心去除細(xì)胞碎片后的裂解液中加入鼠血清和30 μL 1∶1蛋白A和蛋白G瓊脂糖凝膠珠子4℃旋轉(zhuǎn)1 h預(yù)處理，加入1 μg一抗4℃旋轉(zhuǎn)過夜沉淀目的蛋白，然后加入30 μL 1∶1蛋白A和蛋白G瓊脂糖凝膠珠子捕獲所形成的免疫復(fù)合物并沉淀。免疫沉淀得到的蛋白進(jìn)行Western blot分析。

1.2.2 谷胱苷肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白純化 用表達(dá)相關(guān)GST融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21，挑選單個(gè)菌落接種含有100 μg/mL氨芐青霉素的3 mL LB培養(yǎng)基過夜，次日取其中1 mL接種500 mL同樣培養(yǎng)基，當(dāng)光密度在600 nm達(dá)到0.6時(shí)，加入 1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)30℃誘導(dǎo)12 h。然后沉淀細(xì)菌，用STE 緩沖液(100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH 7.5)洗滌1 次，再用3 mL 加入蛋白酶抑制劑的NETN緩沖液(0.5%NP-40，100 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)重新懸浮，冰浴15 min。再加入150 μL 1 mol/L二硫蘇糖醇(DTT)和1.8 mL含有10%肌氨酰(Sarkosyl)的STE緩沖液，在冰中超聲裂解3 min將蛋白溶解。裂解物離心(12000×g，10 min，4℃)分離未溶解成分，將上清成分轉(zhuǎn)移到新的離心管，加入3 mL含有10%Triton X-100的STE緩沖液及200 μL谷胱甘肽瓊脂糖珠，4℃旋轉(zhuǎn)過夜。離心收集與谷胱甘肽瓊脂糖珠結(jié)合的蛋白(2 min，600×g，4℃)并用加有蛋白酶抑制劑的NETN緩沖液洗滌5次。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)純化程度并將純化的蛋白放于4℃保存。

1.2.3 谷胱苷肽-S轉(zhuǎn)移酶共沉淀實(shí)驗(yàn) 對(duì)于細(xì)胞裂解成分的共沉淀分析，首先用RIPA緩沖液(0.5%NP-40、10 mmol/L Tris(pH 7.5)、2 mmol/L EDTA、150 mmol/L NaCl以及蛋白酶抑制劑)處理。裂解物經(jīng)過預(yù)清除然后與谷胱甘肽瓊脂糖珠對(duì)照或相應(yīng)的谷胱甘肽瓊脂糖珠融合蛋白結(jié)合。在體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，谷胱甘肽瓊脂糖珠對(duì)照或相應(yīng)的谷胱甘肽瓊脂糖珠融合蛋白與體外翻譯蛋白在結(jié)合緩沖液 (1×PBS，0.1%NP-40，0.5 mmol/L DTT、10%甘油以及蛋白酶抑制劑)共培育。體外蛋白翻譯采用TNT快速轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)系統(tǒng) (Promega Inc.、Madison、WI)，操作步驟同產(chǎn)品說明。

1.2.4 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)p53蛋白活性采用電穿孔方法將 p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子質(zhì)粒(2 μg)、myc-p53 質(zhì)粒 (10 μg)、PCDNA-ING4(10 μg)、Flag-E6(10 μg)及 Flag-E6 L50G(10 μg)的不同組合分別轉(zhuǎn)染12×106Saos2細(xì)胞。24 h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。用LMAX II384化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞裂解物中的熒光強(qiáng)度，即代表了p53蛋白在轉(zhuǎn)錄水平的活性。取一部分的細(xì)胞裂解物做蛋白免疫印跡檢測(cè)相應(yīng)的蛋白表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，所得結(jié)果為其均值。

1.2.5 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn) 將Myc-p53、PCDNAING4、Flag-E6或Flag-E6 L50G轉(zhuǎn)染Saos2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用加入5 mg/mL G418的DMEM培養(yǎng)基選擇，經(jīng)過2周的篩選，細(xì)胞用4%福爾馬林固定、0.1%結(jié)晶紫染色。用Li-Cor Odyssey計(jì)數(shù)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞集落數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行卡方分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPV16 E6抑制ING4誘導(dǎo)的p53蛋白乙?；?/h3>

為檢測(cè)HPV16 E6對(duì)ING4介導(dǎo)的p53蛋白乙酰化的影響，將PCDNA-ING4和Myc-p53分別與Flag標(biāo)記的HPV16 E6或其變異體L50G共轉(zhuǎn)染SaoS2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞前加入組蛋白去乙?；敢种苿﹖richostatin A再培養(yǎng)6 h穩(wěn)定乙?；膒53蛋白。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的裂解液Western blot顯示HPV16 E6及其突變體L50G對(duì)ING4蛋白的表達(dá)無影響，HPV16 E6能抑制p53蛋白的表達(dá)，而HPV16 E6 L50G主要是抑制p53蛋白的乙?；Ｃ庖吖渤恋韺?shí)驗(yàn)表明HPV16 E6 L50G不能與E6AP結(jié)合，但HPV16 E6及其突變體L50G均能抑制ING4與p53蛋白的結(jié)合，且該作用不依賴于p53蛋白的降解(圖1)。

2.2 HPV16 E6減弱ING4與p53相結(jié)合

Flag-E6及Myc-p53采用T7-TNT快速偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)進(jìn)行蛋白的體外表達(dá)，GST及其標(biāo)記的ING4經(jīng)過大腸埃希菌表達(dá)蛋白與體外翻譯的Flag-E6及Myc-p53蛋白共孵育。在Flag-E6蛋白存在時(shí)，GST-ING4蛋白結(jié)合珠子沉淀的Myc-p53蛋白明顯減少，而作為對(duì)照單獨(dú)GST結(jié)合珠子與這2種蛋白均沒有結(jié)合功能?？捡R斯藍(lán)染色顯示了在結(jié)合實(shí)驗(yàn)中所用的GST及GST-ING4融合蛋白的表達(dá)量。該實(shí)驗(yàn)表明HPV16 E6減弱ING4與p53蛋白的結(jié)合(圖2)。

2.3 HPV16 E6抑制ING4介導(dǎo)的p53基因的轉(zhuǎn)錄

將不同組合的 Flag-E6、Flag-E6 L50G、PCDNA-ING4以及Myc-p53基因質(zhì)粒與p21WAF1/CIP1報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞，36 h后收集、裂解細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。結(jié)果顯示，p53與p21WAF1/CIP1報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染能激活熒光素酶的表達(dá);當(dāng)加入ING4后，p53的下游基因p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子的活性明顯增高;而Flag-E6和其突變體L50G均能減弱p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子的活性(圖3)。圖中標(biāo)準(zhǔn)誤線來自3次實(shí)驗(yàn)。因?yàn)镠PV16 E6 L50G沒有降低p53蛋白表達(dá)的作用，HPV16 E6抑制ING4對(duì)p53蛋白的功能是其發(fā)揮作用的機(jī)制之一。

圖1 HPV16 E6抑制ING4誘導(dǎo)的p53蛋白乙?；疐ig.1 Human papillomavirus 16 E6 suppresses ING4 Induced p53 acetylation

圖2 HPV16 E6抑制ING4與p53蛋白的結(jié)合Fig.2 HPV16 E6 inhibits ING4 binding with p53

圖3 HPV16 E6減弱ING4介導(dǎo)的p53轉(zhuǎn)錄活性Fig.3 HPV16 E6 suppresses the ING4 mediated p53 transcriptional activity

2.4 HPV16 E6抑制ING4誘導(dǎo)的p53途徑細(xì)胞凋亡

圖4 HPV16 E6抑制ING4誘導(dǎo)的p53途徑細(xì)胞凋亡Fig.4 HPV16 E6 suppresses the ING4 mediated apoptosis by p53 pathway

采用細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了HPV16 E6及其突變體L50G對(duì)p53及ING4誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)果表明ING4能加強(qiáng)p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，HPV16 E6能抑制細(xì)胞凋亡，而HPV16 E6對(duì)p53功能的抑制主要表現(xiàn)在ING4存在時(shí)(圖4)。這些結(jié)果證實(shí)了HPV16 E6抑制ING4的誘導(dǎo)凋亡功能。

3 討論

生長(zhǎng)抑制因子(ING)家族參與細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞周期變化及DNA的修復(fù)。在多種惡性腫瘤中其表達(dá)下降，卻極少發(fā)生突變［8］。ING4，作為ING家族中的一員，與p53結(jié)合并調(diào)控其轉(zhuǎn)錄功能，而人體腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要遺傳特征改變就是p53的腫瘤抑制功能的失活。ING4基因位于12號(hào)染色體長(zhǎng)臂13區(qū)編碼由249個(gè)氨基酸組成的蛋白，包括高度保守的C端植物同源結(jié)構(gòu)域(PHD)和2個(gè)細(xì)胞核附著信號(hào)區(qū)。參與染色體重塑的多種蛋白中含有PHD結(jié)構(gòu)域［9］。ING4通過p53依賴性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)理包括提高p53基因的甲基化，抑制Mdm2介導(dǎo)的p53基因降解并提高p53下游基因在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)［10］。ING4與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物 p300結(jié)合而誘導(dǎo)p53蛋白Lys-382的乙酰化［2］。同時(shí)ING4還能與p53結(jié)合并提高其在Lys382位點(diǎn)的甲基化及轉(zhuǎn)錄活性［11］。

HPV16癌蛋白E6是宮頸癌的重要致癌因子。HPV16 E6通過蛋白-蛋白間的相互作用干擾一系列細(xì)胞因子的功能而促進(jìn)細(xì)胞惡變。HPV16 E6抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)理之一是破壞p53的功能。E6與E6AP(一種范素化蛋白連接酶)形成復(fù)合物作用于腫瘤抑制蛋白p53并通過蛋白酶使之降解［12］。宮頸癌細(xì)胞中p53蛋白降解由通過Mdm2途徑轉(zhuǎn)變?yōu)橐揽?HPV16 E6介導(dǎo)途徑［13］。由于ING4與HPV16 E6均作用于p53，我們有理由探討二者之間是否存在相互作用及其生物學(xué)意義。

在相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)HPV16 E6、ING4及p53三種蛋白形成共同復(fù)合物，HPV16 E6減弱ING4與p53蛋白的結(jié)合而抑制細(xì)胞凋亡［5］。進(jìn)一步證實(shí)了HPV16 E6通過阻礙ING4與p53的結(jié)合及其誘導(dǎo)的p53蛋白Lys-382的乙?；鴾p弱p53功能;結(jié)果表明HPV16 E6抑制 p53下游基因p21WAF1/CIP1的表達(dá)及p53介導(dǎo)的凋亡。致癌蛋白HPV16 E6不僅通過直接的p53蛋白降解途徑，而且依靠抑制ING4對(duì)p53作用而抑制細(xì)胞凋亡。作用機(jī)理可能因?yàn)檫@3種蛋白之間存在共同的結(jié)合區(qū)域，因此它們的結(jié)合存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系和抑制關(guān)系。p53蛋白C端賴氨酸的乙?；茉鰪?qiáng)其DNA結(jié)合力、靶基因的選擇以及轉(zhuǎn)錄的激活［14］，抑制ING4誘導(dǎo)的p53蛋白乙?；赡苁荋PV及其他腫瘤病毒引起細(xì)胞癌變的途徑之一。

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