吸光度法快速確定菌懸液濃度及其適用范圍

馬秀玲，陳蕊君，王 飛，徐騰月

(中國(guó)人民解放軍總后勤部 軍需裝備研究所，北京 100010)

微生物生長(zhǎng)中細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定主要有直接計(jì)數(shù)法(測(cè)定時(shí)需用細(xì)菌計(jì)數(shù)器或血球計(jì)數(shù)板，本法僅適于單細(xì)胞的微生物類群)、比濁法、稀釋平板計(jì)數(shù)法、液體稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)法、濃縮法。在一定的濃度范圍內(nèi)，菌懸液中的微生物細(xì)胞濃度與液體的光密度(OD值)成正比，與透光度成反比，因此可以利用分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液的光密度來(lái)推知菌懸液的濃度。由于細(xì)胞濃度僅在一定范圍內(nèi)與光密度呈線性關(guān)系，因此，待測(cè)菌懸液的濃度不宜過(guò)高或過(guò)低，過(guò)高會(huì)超過(guò)儀器的測(cè)量范圍并且細(xì)胞濃度與光密度不呈線性關(guān)系，同時(shí)要求培養(yǎng)液的顏色不宜過(guò)深，并盡量減少顆粒性雜質(zhì)的數(shù)量。該方法的優(yōu)點(diǎn)是快捷簡(jiǎn)便，容易操作;缺點(diǎn)與麥?zhǔn)媳葷岱ㄏ嗤?，即難以區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞以及與微生物類似的雜質(zhì)。另外，形狀不規(guī)則的某些霉菌、放線菌，因菌懸液濃度并不能代表細(xì)胞數(shù)量，所以O(shè)D值和菌懸液濃度不成正比關(guān)系［1］。本實(shí)驗(yàn)以大腸埃希菌為例，先用比濁法制成一定濃度的菌懸液，稀釋后得到不同稀釋度的菌懸液，再通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定不同濃度菌懸液的吸光度值，從而得到在某一濃度范圍內(nèi)菌懸液濃度與吸光度值的線性關(guān)系，同時(shí)應(yīng)用稀釋平板法對(duì)菌落總數(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及試劑 大腸埃希菌(Escherichia coli，ATCC 25922)購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，均121℃高壓滅菌15 min后備用。

1.1.2 儀器 UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本日立公司);LHZ-111落地式恒溫振蕩器(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);BSC-1500ⅡA2-X生物安全柜(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司);LRH-250生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)。

1.2 方法

按照麥?zhǔn)媳葷岱ㄅ渲?×108cfu/g的菌懸液，再將其逐級(jí)稀釋至100 cfu/g，每個(gè)稀釋度在測(cè)定吸光度的同時(shí)用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定其菌落總數(shù)。

1.2.1 待測(cè)菌液的制備 取1環(huán)在石蠟中保存的菌種以劃線法接種到平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基平板上，(36±1)℃培養(yǎng)18～24 h。取TSB培養(yǎng)基100 mL放入錐形瓶中，用接種環(huán)挑取上述平皿上的典型菌落接種在TSB錐形瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為(36 ±1)℃、18 ～24 h，振動(dòng)頻率 110 r/min［2］。

1.2.2 麥?zhǔn)媳葷岱A(yù)估菌懸液濃度 配制稀釋液:取TSB培養(yǎng)基25 mL放入500 mL三角瓶中，再加475 mL無(wú)菌水混勻備用。無(wú)菌操作將被測(cè)定的TSB培養(yǎng)物加到與標(biāo)準(zhǔn)管相同直徑的無(wú)菌試管中［3］。以無(wú)菌操作向被測(cè)定試管加入稀釋液，然后在白紙上劃平行直線，直接用肉眼觀察(利用光在不同濃度液體中的折射不同)，直到濁度與所要求的標(biāo)準(zhǔn)管的濁度相同。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 制備好的菌懸液濃度大約為8×108cfu/g，取0.5 mL稀釋制備成4×108cfu/g菌懸液。以同樣的方式依次稀釋，直到稀釋至100 cfu/g，用UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm［4］下，測(cè)量不同菌懸液的吸光度值。

1.2.4 菌落總數(shù)的測(cè)定 在無(wú)菌條件下，用1 mL移液管吸取不同稀釋度的菌懸液至無(wú)菌平皿中，每個(gè)稀釋度做2個(gè)平皿，同時(shí)分別吸取1 mL空白稀釋液加入2個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)做空白對(duì)照。及時(shí)用15～20 mL冷卻至46℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(可放置于(46±1)℃恒溫水浴保溫)傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，(36±1)℃培養(yǎng)24 h［5］。計(jì)數(shù)各平皿的菌落總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)結(jié)果

測(cè)得的菌懸液平板計(jì)數(shù)結(jié)果及所對(duì)應(yīng)的吸光度值見(jiàn)表1。

表1 不同濃度菌懸液的平板計(jì)數(shù)結(jié)果及所對(duì)應(yīng)的吸光度值Table 1 The count results of bacterial suspension plate of different concentration and the corresponding absorbance values

由表1可見(jiàn)，菌懸液稀釋倍數(shù)較高時(shí)，吸光度值幾乎為零，直到平板菌落總數(shù)達(dá)到6×104cfu/g時(shí)，其對(duì)應(yīng)菌懸液的吸光度值才開(kāi)始出現(xiàn)明顯的變化。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用 6.0 ×104、1.2 ×105、6.0 × 105、1.2 × 106、6.0 ×106、1.2 ×107cfu/g 六個(gè)菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)結(jié)果為橫坐標(biāo)，用對(duì)應(yīng)的菌懸液測(cè)定的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)能達(dá)到0.9952。

圖1 菌落總數(shù)和吸光度值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve between total numbers of colony and absorbance values

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)菌落總數(shù)在63～1.2×104cfu/g之間時(shí)，菌懸液吸光度值變化很小;當(dāng)菌落總數(shù)大于6×104cfu/g時(shí)，吸光度值變化明顯，因此利用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值確定菌懸液濃度方法不適用于菌落總數(shù)在105cfu/g以下的菌懸液。當(dāng)菌落總數(shù)≥6×104cfu/g時(shí)，吸光度值與菌落總數(shù)呈強(qiáng)相關(guān)，R2=0.9952，因此用吸光度法確定菌懸液濃度時(shí)，宜在105～108cfu/g之間。

實(shí)驗(yàn)中由麥?zhǔn)媳葷岱A(yù)估的菌懸液濃度為8×108cfu/g，但實(shí)際測(cè)定的濃度為1.2×107cfu/g。原因是麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ萌庋壑苯佑^察，并且培養(yǎng)基顏色偏黃，與標(biāo)準(zhǔn)管顏色不一致，所測(cè)菌懸液濃度與實(shí)際濃度之間有偏差。本實(shí)驗(yàn)用吸光度法確定菌懸液濃度，并用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行了驗(yàn)證，方法更科學(xué)、更簡(jiǎn)便。

［1］官小紅，楊俊，王庭欣，等.食品微生物學(xué)檢驗(yàn)［M］.北京:中國(guó)計(jì)量出版社，2005:87-88.

［2］朱艷靜，李宇.測(cè)定菌體濃度的簡(jiǎn)便方法［J］.工業(yè)微生物，2006，36(4):47-49.

［3］李瑾，劉振，何艷玲.微生物干粉培養(yǎng)基質(zhì)控圖解手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)技術(shù)出版社，2007:3-5.

［4］熊海燕，王為國(guó)，王存文，等.介紹測(cè)量菌液濃度的一種方法［J］.四川食品與發(fā)酵，2003，(4):45-46.

［5］GB 4789.2-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定［S］.