釀酒酵母中與鈣離子穩(wěn)態(tài)調(diào)控因子ScRCH1細胞質(zhì)膜定位相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因的篩選檢測

杜敬彩，曹春蕾，趙 剛，趙運英，蔣伶活

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

鈣離子是生物的一種必需營養(yǎng)因子，可以調(diào)控生長、繁殖和程序性細胞死亡，以及心臟的肌肉收縮和口中的味覺［1］。鈣穩(wěn)態(tài)(Homeostasis)和鈣調(diào)磷酸酯酶信號途徑在真核細胞中是高度保守的。例如，酵母細胞中鈣通道(Channel)，鈣泵(Pump)和鈣交換器(Exchanger)在哺乳動物的心肌細胞中均有對等的同功蛋白，且作用方式基本相似［2］。哺乳動物細胞中酵母CRZ1的同功蛋白是T細胞中激活的核因子(Nuclear factor activated in T cells，NFAT)，它被鈣調(diào)磷酸酯酶激活后，調(diào)控細胞分化、心臟發(fā)育、受精作用、記憶和肌肉收縮［3］。細胞中鈣穩(wěn)態(tài)是被嚴格調(diào)控的，細胞質(zhì)中鈣濃度被保持在一個最佳的濃度。在外界不同鈣離子環(huán)境下，釀酒酵母細胞質(zhì)中的鈣離子濃度一般維持在50～200 nmol/L［2］。鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控是通過質(zhì)膜和細胞器膜上的鈣轉(zhuǎn)運體(Transporter)和鈣泵的共同作用來實現(xiàn)的［4］。在釀酒酵母中，細胞外鈣離子通常通過未知的轉(zhuǎn)運體“X”和“M”進入細胞質(zhì)［7］。質(zhì)膜上的鈣通道(由 CCH1、MID1和ECM7)組成，控制鈣離子流入細胞質(zhì)，以應(yīng)答內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫和信息素(Pheromone);而哺乳動物細胞TRP通道的同源蛋白—酵母液泡膜蛋白YVC1可以從液泡釋放鈣離子到細胞質(zhì)中，以應(yīng)答低滲休克(Hypotonic shock)［5］。細胞質(zhì)中鈣離子的瞬間升高可以適當?shù)丶せ钼}/鈣調(diào)磷酸酶信號途徑，從而誘導(dǎo)液泡膜上鈣泵基因pmc1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體膜上鈣泵基因pmr1的表達，這對細胞應(yīng)對外界脅迫是至關(guān)重要的。然而，持續(xù)的細胞質(zhì)鈣離子積累對細胞來說是有害的。過多的細胞質(zhì)鈣離子通常通過PMC1鈣泵和Ca2+/H+交換器VCX1被引入液泡，以及被PMR1鈣泵引入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體中［6］。

最近，我們發(fā)現(xiàn)了一個人體溶質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白SLC10家族成員SLC10A7的白念珠菌同系物CaRCH1［7］。CaRCH1 的功能與白念珠菌對鈣離子、鋰離子和唑類藥物的耐受性有關(guān)，負調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)。釀酒酵母中也存在一個與SLC10A7同源的基因ymr034c，之前的轉(zhuǎn)座子突變篩選研究認為ymr034c與唑類藥物的抗性有關(guān)［8］。然而，目前為止未見有對ymr034c其他功能的報道。我們發(fā)現(xiàn)ymr034c是白念珠菌Carch1的同功基因，它們的氨基酸組成序列有52.7%同源性，因此將其命名為Scrch1。我們的初步研究發(fā)現(xiàn)，高鈣離子濃度條件下，ScRCH1-GFP定位于細胞質(zhì)膜上。本研究對釀酒酵母基因組中編碼轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白的223個基因進行系統(tǒng)篩選，發(fā)現(xiàn)6個基因與ScRCH1的表達和細胞質(zhì)膜定位有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本研究所用到的釀酒酵母菌株有野生型BY4743(MATa/α ura3Δ0/ura3Δ0;his3Δ1/his3Δ1;leu2Δ0/leu2Δ0;lys2Δ0/LYS2;MET15/met15Δ0)和以BY4743為背景的釀酒酵母雙倍體單基因缺失株文庫(購自美國 Invitrogen公司)。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①LB培養(yǎng)基:蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH 7.0。配置固體培養(yǎng)基時加入1.5%(w/v)的瓊脂粉;②YPD培養(yǎng)基:蛋白胨2%，葡萄糖2%，酵母提取物1%。配置固體培養(yǎng)基時加入2%(w/v)的瓊脂粉;③SD-Ura培養(yǎng)基:酵母氮源0.67%，葡萄糖2%，滅菌后加入過濾滅菌過的10×必需氨基酸混合母液(不含尿氨酸)。

1.1.3 試劑 基因克隆相關(guān)用限制性內(nèi)切酶和T4連接酶等試劑購自NEB公司;酵母轉(zhuǎn)化用ssDNA、LiAc和 PEG 3350等試劑購自 Sigma公司;Taq DNA聚合酶和Trans1-T1大腸埃希菌感受態(tài)細胞購自北京全式金公司;CaCl2等其他試劑購自國藥集團。

1.1.4 主要實驗儀器 PCR反應(yīng)儀(德國艾本德公司)、全溫搖瓶柜(太倉強樂實驗設(shè)備廠)、臺式冷凍離心機(日本日立公司)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)、熒光顯微鏡(Nikon 80i)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 ScRch1-GFP融合蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建首先通過PCR擴增含有785 bp啟動子序列和沒有終止密碼子的Scrch1基因ORF的一段DNA片段，PCR產(chǎn)物的大小為2087 bp，所用引物為Scrch1-F(CGTTCGACCCATATGTGTCC，下劃線為BamHⅠ位點)和Scrch1-TAG(ACGC CCTTGGTTGT GTATATGG，下劃線為SphⅠ位點)。然后，將這個片段克隆到pGFP33(Michael N.Hall，Switzerland贈送)的BamHⅠ和SphⅠ位點，構(gòu)建出ScRCH1-GFP融合蛋白的表達質(zhì)粒pGFP33-ScRCH1。

1.2.2 酵母細胞轉(zhuǎn)化 挑取活化的酵母單菌落接種于3 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃震蕩過夜培養(yǎng);取1 mL菌液于離心管中，室溫下5000 r/min離心 30 s，棄上清;管中細胞用 100 μL OSB buffer(50 μL 1 mol/L LiAc，20 μL 1 mol/L DTT，6.75 μL 10 mg/mL ssDNA)預(yù)混液重懸;加入適量質(zhì)粒 DNA(200 ng ～2 μg)，160 μL 50%PEG，并充分混勻;于42℃水浴熱激30 min;取出離心管，室溫下5000 r/min離心30 s后，去上清，用500 μL滅菌水洗1次菌體，涂布于所需營養(yǎng)選擇培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，挑取酵母轉(zhuǎn)化子，在SD-URA固體培養(yǎng)基上劃線純化得到的酵母轉(zhuǎn)化子。

1.2.3 細胞預(yù)處理和熒光顯微鏡觀察 挑取帶有pGFP33-ScRCH1質(zhì)粒的酵母單菌落，接種到含有3 mL SD-URA液體培養(yǎng)基的試管中，30℃震蕩過夜培養(yǎng)。分別取100 μL過夜培養(yǎng)液，加入到2份含有900 μL新鮮YPD液體培養(yǎng)基中，在30℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h至對數(shù)生長期，然后向其中1份培養(yǎng)物加入終濃度為0.2 mol/L CaCl2，繼續(xù)培養(yǎng)2 h熒光顯微鏡下觀察ScRCH1-GFP融合蛋白的亞細胞定位情況。每個樣品隨機選取大約有100～200個酵母細胞進行觀察，拍攝DIC和熒光照片。每個菌株隨機選取2個獨立的轉(zhuǎn)化子做熒光定位實驗。

1.2.4 釀酒酵母基因組中編碼轉(zhuǎn)錄因子基因的生物信息學(xué)分析 釀酒酵母雙倍體單基因缺失株文庫包括大約4757個非必需基因的缺失株［9］。SGD數(shù)據(jù)庫(The Saccharomyces Genome Database)檢索結(jié)果顯示，這4757個非必需基因中，共有223個基因編碼轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白，包括轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄輔助因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等，它們共同調(diào)控細胞內(nèi)不同基因的轉(zhuǎn)錄表達(表1)。

表1 編碼酵母細胞轉(zhuǎn)錄因子的223個非必需基因Table 1 List of the 223 nonessential yeast genes encoding transcription factors

續(xù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)cRch1-GFP亞細胞定位的影響

圖1 ScRch1-GFP在野生型(WT)菌株和6個雙倍體基因缺失菌株中的亞細胞定位(1000×)Fig.1 Subcellular localization of ScRCH1-GFP in the wild type and 6 mutant strains(1000 × )

在經(jīng)0.2 mol/L CaCl2處理的野生型酵母細胞中ScRCH1-GFP定位于細胞質(zhì)膜上(圖1)。為了研究Scrch1基因表達的調(diào)控機理，將ScRCH1-GFP質(zhì)粒導(dǎo)入到上述223個編碼轉(zhuǎn)錄因子的雙倍體單基因缺失株中。然后，利用熒光定位的方法檢測0.2 mol/L CaCl2處理前后 ScRCH1-GFP融合蛋白在細胞中的定位情況。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，在不外加鈣離子的YPD培養(yǎng)基中，野生型酵母細胞中沒有觀察到ScRCH1-GFP定位的信號(圖1左邊第1排)。同樣，在不外加鈣離子的YPD培養(yǎng)基中，222個編碼轉(zhuǎn)錄因子基因的缺失株與野生型菌株一樣都沒有ScRCH1-GFP的細胞質(zhì)膜熒光定位(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)果顯示，未經(jīng)鈣離子處理時，這223個基因中唯一1個基因ino2的缺失株中，ScRCH1-GFP已經(jīng)定位到細胞質(zhì)膜上(圖1左邊第4排)。

0.2mol/L CaCl2處理2 h后，野生型酵母細胞中ScRCH1-GFP定位到了細胞質(zhì)膜上(圖1左邊第1排)。相比之下，這223個基因中有5個基因ngg1、hal9、crz1、ada2和 swi6的單基因缺失株細胞中，沒有觀察到ScRCH1-GFP的細胞質(zhì)膜熒光定位(圖1左邊第2～3排，右邊第1～3排)，但是ino2的單基因缺失株細胞中，ScRCH1-GFP的仍然定位在細胞質(zhì)膜上(圖1左邊第4排)。

3 討論

上述實驗結(jié)果表明，編碼釀酒酵母細胞轉(zhuǎn)錄因子的 ino2、ngg1、ada2、hal9、crz1 和 swi6 六個基因的缺失影響了ScRCH1-GFP的正常細胞質(zhì)膜熒光定位，它們在細胞中的已知調(diào)控功能不同(表2)。ino2是異源二聚體轉(zhuǎn)錄激活因子 INO2/INO4螺旋-環(huán)-螺旋的組分，通過與肌糖/膽堿-響應(yīng)元件(ICREs)結(jié)合調(diào)節(jié)磷脂生物合成相關(guān)基因的表達［10］。但是，在 Scrch1啟動子上沒有找到INO2的結(jié)合位點ICRE序列，因此，INO2不可能直接調(diào)控Scrch1的表達。ScRCH1是一個細胞質(zhì)膜蛋白，它的細胞質(zhì)定位也許與磷脂有關(guān)，推測INO2調(diào)控ScRCH1的胞質(zhì)定位可能是間接通過調(diào)控磷脂生物合成相關(guān)基因來完成的。NGG1也被稱為ADA3，是3個修飾染色質(zhì)的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT)復(fù)合物SAGA、SLIK和ADA的組分之一，這3個復(fù)合物的催化亞基為GCN5，可以正向和負向調(diào)控一系列由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的基因的表達［11］。NGG1的C-端和ADA2相互作用形成 NGG1-ADA2-GCN5復(fù)合物［12］。我們還發(fā)現(xiàn)與NGG1存在同一個復(fù)合物中的ADA2，它也是3個復(fù)合物SAGA、SLIK和ADA的組分之一［11］，且發(fā)現(xiàn) ADA2和 NGG1在調(diào)控ScRCH1-GFP細胞質(zhì)膜定位方面的功能一致。由此可見，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物可能正向調(diào)控Scrch1基因的轉(zhuǎn)錄表達，其功能的喪失可能導(dǎo)致Scrch1基因不能被轉(zhuǎn)錄，從而細胞內(nèi)不能合成ScRCH1蛋白，因此也就沒有細胞質(zhì)膜的定位。

HAL9是一個待證實的含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，它的過表達可以增加Na+/Li+泵基因ena1的表達，從而提高細胞對Na+/Li+的耐受性［13］。推測HAL9對Scrch1基因的調(diào)控機理可能類似于它對ena1的調(diào)控。SWI6可以與SWI4和MBP1形成復(fù)合物在G1/S過渡期間調(diào)控轉(zhuǎn)錄，SWI6的核定位受細胞壁脅迫誘導(dǎo)的MPK1p磷酸化的調(diào)控［14］。SWI6對Scrch1基因的調(diào)控機理有待進一步研究。CRZ1是鈣離子激活的鈣調(diào)磷酸酯酶信號途徑的轉(zhuǎn)錄因子，通過基因啟動子上的CDRE序列調(diào)控目的基因的表達，維持細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)。在Scrch1啟動子上發(fā)現(xiàn)了一個潛在的與CRZ1結(jié)合的CDRE序列，因此，CRZ1可能是直接調(diào)控Scrch1的表達。總之，這6個轉(zhuǎn)錄因子基因的發(fā)現(xiàn)為Scrch1基因的表達調(diào)控機理的研究奠定了基礎(chǔ)，有助于對酵母細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的調(diào)控機理的進一步了解。

表2 與ScRCH1亞細胞膜定位有關(guān)的6個轉(zhuǎn)錄因子編碼基因Table 2 List of 6 transcriptional factor-encoding genes involved in ScRCH1 subcellular localization

續(xù)表

［1］Medler KF.Calcium signaling in taste cells:regulation required［J］.Chem Senses，2010，35(9):753-765.

［2］Cui J，Kaandorp JA，Sloot PM，et al.Calcium homeostasis and signaling in yeast cells and cardiac myocytes［J］.FEMS Yeast Res，2009，9(8):1137-1147.

［3］Wu H，Peisley A，Graef IA，et al.NFAT signaling and the invention of vertebrates［J］.Trends Cell Biol，2007，17(6):251-260.

［4］Cui J，Kaandorp JA，Ositelu OO，et al.Simulating calcium influx and free calcium concentrations in yeast［J］.Cell Calcium，2009，45(2):123-132.

［5］Denis V，Cyert MS.Internal Ca(2+)release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue［J］.J Cell Biol，2002，156(1):29-34.

［6］Cyert，MS.Calcineurin signaling in Saccharomyces cerevisiae:how yeast go crazy in response to stress［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，311(4):1143-1150.

［7］Jiang L，Alber J，Wang J，et al.The Candida albicans plasma membrane protein Rch1p，a member of the vertebrate SLC10 carrier family，is a novel regulator of cytosolic Ca2+homoeostasis［J］.Biochemical Journal，2012，444(3):497-502.

［8］Kontoyiannis DP.Genetic analysis of azole resistance by transposon mutagenesis in Saccharomyces cerevisiae［J］.Antimicrob Agents Chemother，1999，43(11):2731-2735.

［9］Zhao Y，Du C，Zhao G，et al.Activation of calcineurin is mainly responsible for the calcium sensitivity of gene deletion mutations in the genome of budding yeast［J］.Genomics，2013，101(1):49-56.

［10］Gardenour KR，Levy J，Lopes JM.Identification of novel dominant INO2c mutants with an Opi-phenotype［J］.Mol Microbiol，2004，52(5):1271-1280.

［11］Pray-Grant MG，Schieltz D，McMahon SJ，et al.The novel SLIK histone acetyltransferase complex functions in the yeast retrograde response pathway［J］.Mol Cell Biol，2002，22(24):8774-8786.

［12］Horiuchi J，Silverman N，Marcus GA，et al.ADA3，a putative transcriptional adaptor，consists of two separable domains and interacts with ADA2 and GCN5 in a trimeric complex［J］.Mol Cell Biol，1995，15(3):1203-1209.

［13］Byrne KP，Wolfe KH.The Yeast Gene Order Browser:combining curated homology and syntenic context reveals gene fate in polyploid species［J］.Genome Res，2005，15(10):1456-1461.

［14］Kim KY，Truman AW，Caesar S，et al.Yeast Mpk1 cell wall integrity mitogen-activated protein kinase regulates nucleocytoplasmic shuttling of the Swi6 transcriptional regulator［J］.Mol Biol Cell，2010，21(9):1609-1619.