液體發(fā)酵法發(fā)酵豆粕產(chǎn)蛋白酶條件的優(yōu)化

王偉+王世英+朱寶成

摘要：為了提高B-15菌株發(fā)酵豆粕產(chǎn)蛋白酶能力，采用單因素法對 B-15菌株發(fā)酵培養(yǎng)基所需的碳源、氮源、無機(jī)鹽進(jìn)行篩選，采用正交試驗(yàn)對B-15菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基組成及發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖為2%、豆粕濃度為12%、KCl為0.01%、MgSO4為0.05%。通過發(fā)酵工藝條件參數(shù)的正交優(yōu)化試驗(yàn)得出發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳工藝參數(shù)為：發(fā)酵時間為48 h，裝瓶量為50 mL，種齡為14 h，pH值為6.5。在此條件下B-15菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力為125.05 U/mL，與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基相比，提高了11.9%。

關(guān)鍵詞：液體發(fā)酵；發(fā)酵條件；正交優(yōu)化；蛋白酶活力

中圖分類號：TQ920.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0273-03

大豆肽是一種比大豆蛋白質(zhì)更為優(yōu)質(zhì)、新型的大豆蛋白酶改性產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵、制藥、食品、化妝品、飼料及植物營養(yǎng)劑等行業(yè)^[1-3]。大豆肽易消化吸收，能迅速供給機(jī)體能量，無蛋白變性，無豆腥味，液體黏性小和受熱不凝固等，并具有降低血清膽固醇^[4]、降低血壓、抗疲勞^[5]、抗氧化^[6]等許多生物功能，因此大豆肽成為研究熱點(diǎn)。目前，大豆肽多采用酶解法和微生物發(fā)酵法生產(chǎn)^[7]，微生物發(fā)酵法把蛋白酶的發(fā)酵生產(chǎn)和大豆肽的酶解生產(chǎn)有機(jī)結(jié)合在一起，降低了大豆肽功能的生產(chǎn)成本，克服了酶水解法制備大豆肽產(chǎn)品的苦味大和口感差等缺點(diǎn)^[8]。目前，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)大豆肽被認(rèn)為是較先進(jìn)有效方法，應(yīng)用前景較好。本試驗(yàn)以蛋白酶活力為指標(biāo)，通過單因素和正交試驗(yàn)對產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌 B-15 發(fā)酵處理豆粕的產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成、發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，以確定最佳的豆粕發(fā)酵產(chǎn)酶工藝，為大豆肽的大規(guī)模液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 細(xì)菌菌株：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）B-15，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基的配制詳見文獻(xiàn)[9]。種子培養(yǎng)基即NB培養(yǎng)基；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕10%、Na2HPO4 0.84%、KH2PO4 0.032%、CaCl2 0.17%、混勻后調(diào)pH值6.0～6.5。

1.1.3 試劑

福林-酚試劑；0.55 mol/L 碳酸鈉溶液、10% 三氯醋酸溶液、0.02 mol/L pH值7.5磷酸緩沖液、1%酪蛋白溶液、100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液，所用試劑皆為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的培養(yǎng)與發(fā)酵

1.2.1.1 搖瓶種子曲線（生長曲線）及種子培養(yǎng)

將斜面培養(yǎng)的菌株接種于NB培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶中的裝瓶量為75 mL（250 mL，下同），在37 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)，在零時開始取樣，以后每隔1 h或2 h取樣1次，直至培養(yǎng)24 h為止，以未接菌的培養(yǎng)基作空白調(diào)零，用分光光度計(jì)在600 nm下測D，以發(fā)酵時間為x軸、以D為y軸作曲線，繪制生長曲線。將斜面培養(yǎng)的菌株接種于NB培養(yǎng)基中，裝瓶量為 75 mL，180 r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)時間由生長曲線確定，得到種子液。

1.2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)

對培養(yǎng)基成分采用以下的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化：將種子液以2%的接種量接入75 mL/250 mL三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵液在5 000 r/min條件下離心10 min，棄去沉淀，收集上清液，進(jìn)行蛋白酶活力測定。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 不同碳源

分別以2%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米淀粉、D-果糖等7種碳源進(jìn)行B-15菌株產(chǎn)酶活力比較試驗(yàn)，配制7種碳源不同的發(fā)酵培養(yǎng)基，均加入10%氮源豆粕，0.84% Na2HPO4，0.032% KH2PO4，0.17% CaCl2，混勻后調(diào)pH值6.0～6.5，篩選出最適碳源。

1.2.2.2 不同氮源濃度

配制豆粕濃度分別為2%、5%、8%、11%、14%的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，進(jìn)行B-15菌株產(chǎn)酶活力比較試驗(yàn)，均加入2%最適碳源，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4、0.17% CaCl2，混勻后調(diào)pH值6.0～6.5，篩選出最適氮源濃度。

1.2.2.3 不同無機(jī)鹽

以濃度為0.05%的CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnCl2、KCl、NaCl、ZnCl2等7種供試無機(jī)鹽進(jìn)行B-15菌株產(chǎn)酶活力比較試驗(yàn)，配制7種無機(jī)鹽不同的發(fā)酵培養(yǎng)基，均加入2%最適碳源，最適氮源濃度的豆粕，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4，混勻后調(diào)pH值6.0～6.5，篩選出最適2種無機(jī)鹽。

1.2.3 正交試驗(yàn)

1.2.3.1 培養(yǎng)基組分

在培養(yǎng)基各組分初步篩選的基礎(chǔ)上，研究培養(yǎng)基成分的不同配比對酶活力的影響。選用L16（44）設(shè)計(jì)方案設(shè)計(jì)4因素4水平正交試驗(yàn)（表1），根據(jù)上述試驗(yàn)確定的最適碳源、氮源、無機(jī)鹽配制不同組成的培養(yǎng)基，測定發(fā)酵菌株產(chǎn)酶活力。綜合正交試驗(yàn)結(jié)果，初步確定最佳組合，得出B-15菌株產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基組成。

肽發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組成，即葡萄糖為2%，豆粕濃度為12%，KCl為0.01%，MgSO4為0.05%。通過對其進(jìn)行發(fā)酵工藝條件參數(shù)的正交優(yōu)化試驗(yàn)得出發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳工藝參數(shù)，即發(fā)酵時間為48 h，裝瓶量為50 mL，種齡為14 h，pH值為6.5。在此條件下，B-15菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力為125.05 U/mL，與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基相比提高了11.9%，研究結(jié)果為進(jìn)一步利用豆粕提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]豆康寧，董 彬，王銀滿. 大豆蛋白活性肽的生物功能與應(yīng)用前景[J]. 糧食加工，2007，32（2）：52-54.

[2]鄧成萍，張 惠，魏秀英.大豆低聚肽的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)，2004，25（增刊）：236-240.

[3]王 靜，郝再彬. 大豆肽的特性和功能及研究進(jìn)展[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（5）：32-36.

[4]宋俊梅，曲靜然，徐少萍. 大豆肽的研究進(jìn)展（待續(xù)）[J]. 山東輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，16（3）：1-3.

[5]鄭哲君，李曉莉，王 朔. 抗疲勞功能食品的研究進(jìn)展[J]. 食品科技，2006，31（2）：4-7.

[6]Chen H M，Muramoto K，Yamauchi F. Structural analysis of antioxidative peptides from soybean β-conglycinin[J]. Agric and Food Chem，1995，43（5）：574-578.

[7]方海紅，胡好遠(yuǎn)，黃紅英，等. 微生物堿性蛋白酶的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2002，29（2）：57-59.

[8]鄧 勇，吳煜歡. 微生物蛋白酶對大豆分離蛋白水解作用的研究[J]. 食品科學(xué)，1999，20（6）：42-45.

[9]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001：351.

[10]Iemura Y，Yamada T，Takahashi T，et al. Properties of the peptides liberated from rice protein in sokujo-moto[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，1999，88（3）：276-280.

[11]李志忠，袁惠君，張丙云，等. 大豆多肽的功能與開發(fā)研究[J]. 甘肅科技，2006，22（4）：179-181.endprint

摘要：為了提高B-15菌株發(fā)酵豆粕產(chǎn)蛋白酶能力，采用單因素法對 B-15菌株發(fā)酵培養(yǎng)基所需的碳源、氮源、無機(jī)鹽進(jìn)行篩選，采用正交試驗(yàn)對B-15菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基組成及發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖為2%、豆粕濃度為12%、KCl為0.01%、MgSO4為0.05%。通過發(fā)酵工藝條件參數(shù)的正交優(yōu)化試驗(yàn)得出發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳工藝參數(shù)為：發(fā)酵時間為48 h，裝瓶量為50 mL，種齡為14 h，pH值為6.5。在此條件下B-15菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力為125.05 U/mL，與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基相比，提高了11.9%。

關(guān)鍵詞：液體發(fā)酵；發(fā)酵條件；正交優(yōu)化；蛋白酶活力

中圖分類號：TQ920.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0273-03

大豆肽是一種比大豆蛋白質(zhì)更為優(yōu)質(zhì)、新型的大豆蛋白酶改性產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵、制藥、食品、化妝品、飼料及植物營養(yǎng)劑等行業(yè)^[1-3]。大豆肽易消化吸收，能迅速供給機(jī)體能量，無蛋白變性，無豆腥味，液體黏性小和受熱不凝固等，并具有降低血清膽固醇^[4]、降低血壓、抗疲勞^[5]、抗氧化^[6]等許多生物功能，因此大豆肽成為研究熱點(diǎn)。目前，大豆肽多采用酶解法和微生物發(fā)酵法生產(chǎn)^[7]，微生物發(fā)酵法把蛋白酶的發(fā)酵生產(chǎn)和大豆肽的酶解生產(chǎn)有機(jī)結(jié)合在一起，降低了大豆肽功能的生產(chǎn)成本，克服了酶水解法制備大豆肽產(chǎn)品的苦味大和口感差等缺點(diǎn)^[8]。目前，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)大豆肽被認(rèn)為是較先進(jìn)有效方法，應(yīng)用前景較好。本試驗(yàn)以蛋白酶活力為指標(biāo)，通過單因素和正交試驗(yàn)對產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌 B-15 發(fā)酵處理豆粕的產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成、發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，以確定最佳的豆粕發(fā)酵產(chǎn)酶工藝，為大豆肽的大規(guī)模液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 細(xì)菌菌株：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）B-15，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基的配制詳見文獻(xiàn)[9]。種子培養(yǎng)基即NB培養(yǎng)基；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕10%、Na2HPO4 0.84%、KH2PO4 0.032%、CaCl2 0.17%、混勻后調(diào)pH值6.0～6.5。

1.1.3 試劑

福林-酚試劑；0.55 mol/L 碳酸鈉溶液、10% 三氯醋酸溶液、0.02 mol/L pH值7.5磷酸緩沖液、1%酪蛋白溶液、100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液，所用試劑皆為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的培養(yǎng)與發(fā)酵

1.2.1.1 搖瓶種子曲線（生長曲線）及種子培養(yǎng)

將斜面培養(yǎng)的菌株接種于NB培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶中的裝瓶量為75 mL（250 mL，下同），在37 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)，在零時開始取樣，以后每隔1 h或2 h取樣1次，直至培養(yǎng)24 h為止，以未接菌的培養(yǎng)基作空白調(diào)零，用分光光度計(jì)在600 nm下測D，以發(fā)酵時間為x軸、以D為y軸作曲線，繪制生長曲線。將斜面培養(yǎng)的菌株接種于NB培養(yǎng)基中，裝瓶量為 75 mL，180 r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)時間由生長曲線確定，得到種子液。

1.2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)

對培養(yǎng)基成分采用以下的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化：將種子液以2%的接種量接入75 mL/250 mL三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵液在5 000 r/min條件下離心10 min，棄去沉淀，收集上清液，進(jìn)行蛋白酶活力測定。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 不同碳源

分別以2%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米淀粉、D-果糖等7種碳源進(jìn)行B-15菌株產(chǎn)酶活力比較試驗(yàn)，配制7種碳源不同的發(fā)酵培養(yǎng)基，均加入10%氮源豆粕，0.84% Na2HPO4，0.032% KH2PO4，0.17% CaCl2，混勻后調(diào)pH值6.0～6.5，篩選出最適碳源。

1.2.2.2 不同氮源濃度

配制豆粕濃度分別為2%、5%、8%、11%、14%的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，進(jìn)行B-15菌株產(chǎn)酶活力比較試驗(yàn)，均加入2%最適碳源，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4、0.17% CaCl2，混勻后調(diào)pH值6.0～6.5，篩選出最適氮源濃度。

1.2.2.3 不同無機(jī)鹽

以濃度為0.05%的CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnCl2、KCl、NaCl、ZnCl2等7種供試無機(jī)鹽進(jìn)行B-15菌株產(chǎn)酶活力比較試驗(yàn)，配制7種無機(jī)鹽不同的發(fā)酵培養(yǎng)基，均加入2%最適碳源，最適氮源濃度的豆粕，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4，混勻后調(diào)pH值6.0～6.5，篩選出最適2種無機(jī)鹽。

1.2.3 正交試驗(yàn)

1.2.3.1 培養(yǎng)基組分

在培養(yǎng)基各組分初步篩選的基礎(chǔ)上，研究培養(yǎng)基成分的不同配比對酶活力的影響。選用L16（44）設(shè)計(jì)方案設(shè)計(jì)4因素4水平正交試驗(yàn)（表1），根據(jù)上述試驗(yàn)確定的最適碳源、氮源、無機(jī)鹽配制不同組成的培養(yǎng)基，測定發(fā)酵菌株產(chǎn)酶活力。綜合正交試驗(yàn)結(jié)果，初步確定最佳組合，得出B-15菌株產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基組成。

肽發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組成，即葡萄糖為2%，豆粕濃度為12%，KCl為0.01%，MgSO4為0.05%。通過對其進(jìn)行發(fā)酵工藝條件參數(shù)的正交優(yōu)化試驗(yàn)得出發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳工藝參數(shù)，即發(fā)酵時間為48 h，裝瓶量為50 mL，種齡為14 h，pH值為6.5。在此條件下，B-15菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力為125.05 U/mL，與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基相比提高了11.9%，研究結(jié)果為進(jìn)一步利用豆粕提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]豆康寧，董 彬，王銀滿. 大豆蛋白活性肽的生物功能與應(yīng)用前景[J]. 糧食加工，2007，32（2）：52-54.

[2]鄧成萍，張 惠，魏秀英.大豆低聚肽的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)，2004，25（增刊）：236-240.

[3]王 靜，郝再彬. 大豆肽的特性和功能及研究進(jìn)展[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（5）：32-36.

[4]宋俊梅，曲靜然，徐少萍. 大豆肽的研究進(jìn)展（待續(xù)）[J]. 山東輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，16（3）：1-3.

[5]鄭哲君，李曉莉，王 朔. 抗疲勞功能食品的研究進(jìn)展[J]. 食品科技，2006，31（2）：4-7.

[6]Chen H M，Muramoto K，Yamauchi F. Structural analysis of antioxidative peptides from soybean β-conglycinin[J]. Agric and Food Chem，1995，43（5）：574-578.

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[9]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001：351.

[10]Iemura Y，Yamada T，Takahashi T，et al. Properties of the peptides liberated from rice protein in sokujo-moto[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，1999，88（3）：276-280.

[11]李志忠，袁惠君，張丙云，等. 大豆多肽的功能與開發(fā)研究[J]. 甘肅科技，2006，22（4）：179-181.endprint

摘要：為了提高B-15菌株發(fā)酵豆粕產(chǎn)蛋白酶能力，采用單因素法對 B-15菌株發(fā)酵培養(yǎng)基所需的碳源、氮源、無機(jī)鹽進(jìn)行篩選，采用正交試驗(yàn)對B-15菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基組成及發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖為2%、豆粕濃度為12%、KCl為0.01%、MgSO4為0.05%。通過發(fā)酵工藝條件參數(shù)的正交優(yōu)化試驗(yàn)得出發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳工藝參數(shù)為：發(fā)酵時間為48 h，裝瓶量為50 mL，種齡為14 h，pH值為6.5。在此條件下B-15菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力為125.05 U/mL，與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基相比，提高了11.9%。

關(guān)鍵詞：液體發(fā)酵；發(fā)酵條件；正交優(yōu)化；蛋白酶活力

中圖分類號：TQ920.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0273-03

大豆肽是一種比大豆蛋白質(zhì)更為優(yōu)質(zhì)、新型的大豆蛋白酶改性產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵、制藥、食品、化妝品、飼料及植物營養(yǎng)劑等行業(yè)^[1-3]。大豆肽易消化吸收，能迅速供給機(jī)體能量，無蛋白變性，無豆腥味，液體黏性小和受熱不凝固等，并具有降低血清膽固醇^[4]、降低血壓、抗疲勞^[5]、抗氧化^[6]等許多生物功能，因此大豆肽成為研究熱點(diǎn)。目前，大豆肽多采用酶解法和微生物發(fā)酵法生產(chǎn)^[7]，微生物發(fā)酵法把蛋白酶的發(fā)酵生產(chǎn)和大豆肽的酶解生產(chǎn)有機(jī)結(jié)合在一起，降低了大豆肽功能的生產(chǎn)成本，克服了酶水解法制備大豆肽產(chǎn)品的苦味大和口感差等缺點(diǎn)^[8]。目前，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)大豆肽被認(rèn)為是較先進(jìn)有效方法，應(yīng)用前景較好。本試驗(yàn)以蛋白酶活力為指標(biāo)，通過單因素和正交試驗(yàn)對產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌 B-15 發(fā)酵處理豆粕的產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成、發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，以確定最佳的豆粕發(fā)酵產(chǎn)酶工藝，為大豆肽的大規(guī)模液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 細(xì)菌菌株：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）B-15，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基的配制詳見文獻(xiàn)[9]。種子培養(yǎng)基即NB培養(yǎng)基；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕10%、Na2HPO4 0.84%、KH2PO4 0.032%、CaCl2 0.17%、混勻后調(diào)pH值6.0～6.5。

1.1.3 試劑

福林-酚試劑；0.55 mol/L 碳酸鈉溶液、10% 三氯醋酸溶液、0.02 mol/L pH值7.5磷酸緩沖液、1%酪蛋白溶液、100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液，所用試劑皆為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的培養(yǎng)與發(fā)酵

1.2.1.1 搖瓶種子曲線（生長曲線）及種子培養(yǎng)

將斜面培養(yǎng)的菌株接種于NB培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶中的裝瓶量為75 mL（250 mL，下同），在37 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)，在零時開始取樣，以后每隔1 h或2 h取樣1次，直至培養(yǎng)24 h為止，以未接菌的培養(yǎng)基作空白調(diào)零，用分光光度計(jì)在600 nm下測D，以發(fā)酵時間為x軸、以D為y軸作曲線，繪制生長曲線。將斜面培養(yǎng)的菌株接種于NB培養(yǎng)基中，裝瓶量為 75 mL，180 r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)時間由生長曲線確定，得到種子液。

1.2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)

對培養(yǎng)基成分采用以下的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化：將種子液以2%的接種量接入75 mL/250 mL三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵液在5 000 r/min條件下離心10 min，棄去沉淀，收集上清液，進(jìn)行蛋白酶活力測定。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 不同碳源

分別以2%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米淀粉、D-果糖等7種碳源進(jìn)行B-15菌株產(chǎn)酶活力比較試驗(yàn)，配制7種碳源不同的發(fā)酵培養(yǎng)基，均加入10%氮源豆粕，0.84% Na2HPO4，0.032% KH2PO4，0.17% CaCl2，混勻后調(diào)pH值6.0～6.5，篩選出最適碳源。

1.2.2.2 不同氮源濃度

配制豆粕濃度分別為2%、5%、8%、11%、14%的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，進(jìn)行B-15菌株產(chǎn)酶活力比較試驗(yàn)，均加入2%最適碳源，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4、0.17% CaCl2，混勻后調(diào)pH值6.0～6.5，篩選出最適氮源濃度。

1.2.2.3 不同無機(jī)鹽

以濃度為0.05%的CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnCl2、KCl、NaCl、ZnCl2等7種供試無機(jī)鹽進(jìn)行B-15菌株產(chǎn)酶活力比較試驗(yàn)，配制7種無機(jī)鹽不同的發(fā)酵培養(yǎng)基，均加入2%最適碳源，最適氮源濃度的豆粕，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4，混勻后調(diào)pH值6.0～6.5，篩選出最適2種無機(jī)鹽。

1.2.3 正交試驗(yàn)

1.2.3.1 培養(yǎng)基組分

在培養(yǎng)基各組分初步篩選的基礎(chǔ)上，研究培養(yǎng)基成分的不同配比對酶活力的影響。選用L16（44）設(shè)計(jì)方案設(shè)計(jì)4因素4水平正交試驗(yàn)（表1），根據(jù)上述試驗(yàn)確定的最適碳源、氮源、無機(jī)鹽配制不同組成的培養(yǎng)基，測定發(fā)酵菌株產(chǎn)酶活力。綜合正交試驗(yàn)結(jié)果，初步確定最佳組合，得出B-15菌株產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基組成。

肽發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組成，即葡萄糖為2%，豆粕濃度為12%，KCl為0.01%，MgSO4為0.05%。通過對其進(jìn)行發(fā)酵工藝條件參數(shù)的正交優(yōu)化試驗(yàn)得出發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳工藝參數(shù)，即發(fā)酵時間為48 h，裝瓶量為50 mL，種齡為14 h，pH值為6.5。在此條件下，B-15菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力為125.05 U/mL，與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基相比提高了11.9%，研究結(jié)果為進(jìn)一步利用豆粕提供了理論依據(jù)。

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