栝樓性別的分化與鑒定研究進展

寧志怨+董玲+李衛(wèi)文+廖華俊+江芹

摘要：栝樓是常用的大宗藥用植物，其性別分化一直是研究的重點。本文對栝樓雌、雄性別分化的組織形態(tài)鑒別、生理生化鑒別、性別相關基因的分子標記鑒別等進行綜述，并對今后栝樓性別研究的發(fā)展趨勢進行了展望，最后提出了相關建議。

關鍵詞：栝樓；雌雄異株；性別分化；性別鑒定

中圖分類號：S567.23+9.03 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0004-03

栝樓（Trichosanthes kirilowii L.），又稱瓜蔞、吊瓜、野葫蘆等，屬葫蘆科栝樓屬多年生草本植物，是我國常用的中藥材，主要分布在東亞以及澳大利亞的北部地區(qū)，國內種植地區(qū)主要包栝河北、山東、長江流域以及華南和西南等地區(qū)。栝樓的果實、果皮、仁、根皆可入藥，有解熱止渴、利尿、鎮(zhèn)咳祛痰等作用，栝樓制劑對冠心病心絞痛有一定療效。栝樓的根又名天花粉，含有淀粉、皂苷、天花粉蛋白、多種氨基酸以及多糖類等物質。近些年研究發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白具有抗腫瘤及抗艾滋病的活性，天花粉多糖具有明顯的免疫調節(jié)作用，能增強免疫活性，具有顯著的抗腫瘤和細胞毒活性。栝樓的種子營養(yǎng)豐富，富含不飽和脂肪酸、氨基酸以及多糖類等物質。近年來栝樓種植面積迅速擴大，產業(yè)前景潛力巨大。

栝樓是雌雄異株，隨著栝樓種子被開發(fā)為休閑保健食用栝樓籽、栝樓油等，生產上栝樓種植主要以雌株為主，雄株主要作為授粉植株；而另一方面以收獲地下塊根（天花粉）為目標的主要以種植雄株為主。用栝樓種子繁育的后代，雄株的比例一般均超過90%，因此研究栝樓種子后代性別分化的機理以及性別的苗期鑒定對于栝樓的育種研究具有非常重要的作用。除此之外，植物性別一直是植物生殖生物學和植物遺傳學研究所關注的核心。性別分化的模式植物黃瓜的性別分化研究目前已經(jīng)取得了突破性的進展。最新的研究結果表明乙烯代謝途徑的相關基因對雌雄同株的黃瓜的性別分化起著非常重要的作用。而雌雄異株植物栝樓的性別分化的機理還未見相關報道。因此研究栝樓性別分化的機理以及性別的鑒定對于研究雌雄異株植物的性別分化的機理具有非常重要的作用。植物性別是一種自然現(xiàn)象，既有遺傳物質基礎，也容易受生長發(fā)育過程中各種環(huán)境因素的影響，存在著與動物性別不同的遺傳規(guī)律和調節(jié)方式。因此，研究植物性別現(xiàn)象及其遺傳機制對于尋求早期鑒定性別的方法以達到人為控制植物性別分化的目的，這在植物學和農業(yè)生產上具有非常重要的應用價值。

1 栝樓的性別表現(xiàn)類型與特點

栝樓屬植物一般認為是嚴格的雌雄異株植物，但是我們在研究過程中觀察到偶有少數(shù)植株是雌雄同株，存在著性別的多樣性。栝樓雌株的雌花與雄株的雄花都屬于生理上的單性花。研究結果表明在雌雄異株植物中，單性別主要由遺傳決定，但是單性性別的表達可能受到激素和環(huán)境因子等影響^[1-2]。

2 栝樓性別分化與鑒定

2.1 組織形態(tài)學

在雌、雄栝樓染色體的研究方面：Karmakar等在對栝樓二倍體雌、雄株染色體進行觀察時發(fā)現(xiàn)，二倍體雌、雄株染色體之間不存在XY型染色體的分化，認為栝樓的性別表達可能主要是由遺傳控制的^[3]。

在雌、雄栝樓花器官的形態(tài)學研究方面：花期雄花單生、總狀花序或兩者并生，雌花則為單生，據(jù)此可較為明確地區(qū)分栝樓的雌、雄株。雄株出現(xiàn)花蕾的同時花梗伸長，繼而開花；而雌株最先是花梗伸長，子房開始膨大，然后出現(xiàn)花蕾繼而開花，即雌株果實從分化初始就出現(xiàn)子房膨大。因此雌、雄花蕾未出現(xiàn)前即可通過花梗伸長后是否出現(xiàn)子房膨大判定雌、雄株。根據(jù)這種方法并結合花期和果期來判定性別進行驗證，準確率達100%。除此之外，花蕾開放以后，雄花的五朵花瓣完全展開，雌花花瓣仍皺縮在一起；雄花中可見明顯的黃色花藥，不見柱頭，雌花中可見明顯的三裂柱頭。通過以上幾種特征，均可以可靠區(qū)分雄株和雌株。曲超等在對栝樓種子的質量與栝樓性別的研究過程中發(fā)現(xiàn)，隨著種子質量的增加，由該種子長出的植株的雄株比例逐漸減少，雌株比例逐漸增加，雌株比例與種子大小存在顯著正相關，相關系數(shù)為0.948 8，同時也發(fā)現(xiàn)18%的雌花中出現(xiàn)花藥的情況，但電鏡掃描的結果卻表明花藥中并不存在花粉^[4]。另一方面我們在研究中發(fā)現(xiàn)少量雄株中存在雌蕊發(fā)育的情況。

2.2 生理、生化

植物激素、多胺、可溶性糖的含量以及一些酶的活性等都與性別分化關系密切。因此可以通過對不同性別栝樓葉片內的激素、多胺、可溶性糖含量以及一些酶的活性等生理、生化方面的差異來對栝樓的性別進行鑒別。

孫永剛利用BTB、甲基紅和溴酚藍對栝樓的雌、雄株幼苗葉片的提取液進行研究，結果表明雄株的反應明顯比雌株深，分光光度計的研究結果同時顯示雌、雄株的染色液在特定波長的吸光值差異顯著^[5]。李珊等測定雌、雄植株葉片生理生化指標以及采用HPLC法對雌雄植株葉片化學成分進行研究，結果表明雄株的光合色素含量、可溶性蛋白質含量、SOD活性、POD活性、DNA濃度高于雌株，其中光合色素的量、POD活性差異達顯著水平。雌株的MDA、可溶性糖、紫外吸收物的量高于雄株，其中紫外吸收物的量差異達顯著水平^[6]。郭曉亮用比色法研究了雌、雄栝樓幼苗葉片中水溶性酚類物質、可溶性糖、還原性糖、抗壞血酸及光合色素等內含物含量的差異，結果表明，雄性栝樓幼苗葉片中水溶性酚類物質、葉綠素B及光合色素含量極顯著高于雌性栝樓；可溶性糖、抗壞血酸、葉綠素A、類胡蘿卜素等含量，雄性顯著高于雌性，而還原性糖含量雌性極顯著高于雄性^[7]。

曲超等利用酒石酸鐵和蒽酮比色法來對不同性別的栝樓生理、生化指標進行測定，結果顯示，在花期雌、雄株葉片在水溶性酚和可溶性糖含量上存在顯著差異，同時研究結果也顯示雌株葉片的還原性高于雄株葉片^[4]。劉蕓等在栝樓生長發(fā)育各階段，采用高效液相色譜技術分別對雌、雄植株葉片內源激素及多胺含量進行分析，結果表明，在所測定的生長發(fā)育期，吲哚乙酸、亞精胺含量，雌株始終高于雄株；而脫落酸、精胺含量雌株始終低于雄株；玉米素核苷、赤霉素和腐胺含量在營養(yǎng)生長期雄株高于雌株，雄株進入生殖生長階段后迅速下降^[8]。劉蕓等對栝樓雌、雄植株生長發(fā)育關鍵時期的光合作用和蒸騰作用進行研究，結果表明，在營養(yǎng)生長階段，栝樓雄株的光合速率、蒸騰速率、氣孔導度和水分利用效率均大于雌株；雄株比雌株提前22 d進入生殖生長階段。當雄株進入生殖生長階段后，其光合速率、蒸騰速率和氣孔導度大于雌株，但水分利用效率略小于雌株^[9]。張偉等以4個地區(qū)的8個栝樓品系為材料，采用蒽酮比色法測定了不同栝樓品種開花期間葉片的可溶性糖含量，結果表明，不同產區(qū)的栝樓雌、雄株葉片中的可溶性糖在開花期不盡相同，認為單純的從開花期葉片可溶性糖含量表現(xiàn)出差異的角度試圖揭示栝樓雌、雄差異的現(xiàn)象，進而尋求對其進行早期鑒別的技術可能比較困難^[10]。劉偉等采用陽離子交換樹脂分離Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn 6種元素的游離態(tài)和非游離態(tài)，結果顯示雌、雄栝樓天花粉中的6種元素存在形態(tài)不一致，游離態(tài)和無機態(tài)為主要存在形式，雌、雄栝樓在元素形態(tài)上的差異僅存在于無機態(tài)的Ca和Mg^[11]。

2.3 分子標記

于鳳池等對栝樓雌、雄株不同器官進行過氧化物酶同工酶活性和電泳分析。結果表明，雌株的過氧化物酶同工酶活性高于雄株，且雌株葉片中有一條特異性的過氧化物酶同工酶譜帶；雄株花芽中存在一種23 400的特異蛋白質，雄花中一種32 300的蛋白質在受精后消失^[12]。李彥農通過葉片總DNA抽提、RAPD標記分析及反復的試驗篩選。在80個RAPD引物中，用引物AN18擴增得到一條約0.6 kb與雄性栝樓相連鎖的多態(tài)性片段（TKM647），對該片段進行了克隆與序列分析，但是轉化SCAR標記卻沒有成功^[13]。孫永剛在栝樓的雌、雄株之間進行同工酶電泳，結果表明雌、雄株在過氧化物酶同功酶圖譜分析中共得到4條和性別相關的譜帶；多酚氧化酶同功酶則有3條與雌株有關的標記。另一方面建立了可用于栝樓雌、雄鑒別的AFLP反應體系，雌、雄集群間檢測到71個AFLP多態(tài)性標記，其中40條來自雌株，31條來自雄株，分離比大約為1.3 ∶[KG-*3]1^[5]。Kumar等利用41對隨機引物分別對雌性、雄性和單性結實系的基因池進行研究，結果顯示2個標記OPC05-1000和OPC14-400能夠在雌、雄栝樓中穩(wěn)定擴增出差異條帶，可以用于栝樓性別的鑒別^[14]。Seneviratne等利用幾百條RAPD引物對雌、雄栝樓的基因組進行擴增反應，結果顯示引物OPC-7擴增產生的1條564 bp的條帶能夠準確地區(qū)分雌、雄株，并認為雌、雄株之間差異性的條帶的發(fā)現(xiàn)將有助于在分子水平上了解雙子葉植物的性別決定^[15]。Roy等在栝樓性別發(fā)育時期采用cDNA-AFLP的方法對雌、雄栝樓的表達水平進行研究，在雌雄株之間共有31個上調或下調的基因片段被選擇用于測序，其中23個來源于雄性，8個來源于雌性。生物信息學分析結果表明其中一個來源于雄性的克隆，具有多聚半乳糖醛酸酶基因的功能，該基因參與花粉的發(fā)育、萌發(fā)以及在花粉管的伸長過程中起解聚角質的作用^[16]。郭曉亮對不同時期栝樓幼苗葉片中的醋酶、過氧化物酶、細胞色素氧化酶等同工酶進行了電泳分析，結果表明，同一時期，不同性別的栝樓，同工酶在譜帶、酶含量上存在一定的差異；其中，酯酶同工酶中的特異性譜帶Rf 0.439在雄性栝樓苗期較長時期內表現(xiàn)比較明顯，可望作為栝樓苗期性別鑒別的特異性指標^[7]。曲益濤利用92個隨機引物并選用優(yōu)化過的RAPD反應體系對同一來源的栝樓組培后代雌、雄株DNA分別進行PCR擴增，發(fā)現(xiàn)1條600 bp特異性條帶與雄性連鎖，將這一特異條帶最終成功實現(xiàn)RAPD轉化為SCAR標記。但是筆者所在研究室進一步的研究結果顯示，當采用不同來源的栝樓雌、雄株時，SCAR標記卻未能有效地鑒別栝樓的雌、雄株^[17]。Kumar等利用RAPD引物對42個栝樓組培后代的雌、雄株以及單性結實系進行分子鑒別研究，結果表明標記OPC05-1000的條帶只存在于雄性栝樓的基因池中，標記OPC14-400只存在雌性栝樓的基因池中，上述2個標記能夠穩(wěn)定在開花前用于栝樓雌、雄株的鑒別^[18]。Nanda等利用40個ISSR引物對雌、雄性基因池進行篩選，結果篩選到1個和雄性連鎖的720 bp標記TdMSM，Southern雜交結果表明該標記僅存在于雄性栝樓中，除此之外該標記可以有效地區(qū)分未知性別的15個不同性別的栝樓^[19]，但是在筆者的研究中該標記未能有效地鑒別栝樓雌、雄株。Karmakar等對二倍體栝樓雌、雄株塊根的蛋白進行SDS-PAGE電泳，結果顯示：在還原性的SDS-PAGE電泳時，雌、雄株之間沒有發(fā)現(xiàn)明顯條帶差異，只是存在條帶濃度的差異；然而當使用15 μg的蛋白進行非還原性電泳時，栝樓雌雄株之間出現(xiàn)條帶的有無以及強度差異^[3]。

3 展望

栝樓的性別表達由基因決定，因此利用分子生物學技術在基因表達水平上研究雌、雄株之間的差異性，從中找到性別差異的片段并進行分析，從而建立栝樓性別分化的遺傳規(guī)律。但是栝樓的性別分化的差異歸根結底是表現(xiàn)在花器官上，花器官形成機理的研究將有助于了解其性別分化的形態(tài)發(fā)生過程和控制機理，在此基礎上進一步了解其性別分化各時期中各種生理生化指標的變化規(guī)律，將為栝樓的性別遺傳規(guī)律的研究提供切實的依據(jù)。目前一般認為栝樓的性別分化主要受遺傳控制并且是嚴格的雌、雄異株植物，但是我們在最新的研究中則發(fā)現(xiàn)一些植物激素能夠使離體的栝樓組織性別發(fā)生變異[17，20]。與此同時，最新的研究結果表明番木瓜原始Y染色體的雄性特異區(qū)中DNA甲基化和異染色質化參與番木瓜的性別發(fā)育過程，從而達到開啟或關閉一些和性別相關基因的表達最終來控制番木瓜的性別的分化^[21]。栝樓和番木瓜一樣同屬于雌雄異株植物，可能通過染色體區(qū)段的異染色質化來調控栝樓的性別分化。也可能在外界激素的作用或組織培養(yǎng)條件下，可能通過開啟或關閉一些和花器官發(fā)育相關的基因表達來調控栝樓的性別分化。

綜上所述，一般認為栝樓的性別的表達主要由遺傳決定，但是最近的研究結果表明，栝樓性別的表達除了受到遺傳控制之外，還受到一些激素等因素的影響，從而在受到外源激素的作用或在組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)花器官畸變和性別變異的現(xiàn)象。因此在未來的栝樓性別的研究過程中，除了主要從遺傳上來進行研究外，還要充分考慮植物激素對栝樓花器官性別分化的影響。尤其是在組織培養(yǎng)過程中，栝樓莖尖分生組織有可能會由于激素的作用而不能保持外植體原有的性別的可能性。今后栝樓性別的研究方向為：（1）構建栝樓性別分化的無性系，研究植物激素對栝樓性別的影響。分別對栝樓雌株和雄株進行離體組織培養(yǎng)，研究不同的植物激素對不同性別的無性系后代群體性別的影響，篩選合適的植物激素，從而避免栝樓在組織培養(yǎng)過程中性別容易發(fā)生變異的情況。（2）提高栝樓種子的發(fā)芽率，以便于深入研究栝樓雜交后代群體的性別表達的遺傳規(guī)律，為探討栝樓的性別分化的遺傳規(guī)律奠定基礎。（3）通過在基因水平上對不同性別的栝樓進行研究，同時借鑒同屬于葫蘆科的模式植物黃瓜的性別分化的機理研究成果，來探索激素調控栝樓性別分化的可能機理。

參考文獻：

[1]Durand B，Durand R. Sex determination and reproductive organ differentiation in Mercurialis[J]. Plant Science，1991，80（1）：49-65.

[2]Chailakhyan M K，Khrianin V N. Sexuality in plants and its hormonal regulation[M]. Heidelberg：Springer-Verlag，1987.

[3]Karmakar K，Sinha R K，Sinha S. Karyological and electrophoretic distinction between sexes of Trichosanthes bracteata[J]. American Journal of Plant Sciences，2013（4）：494-497.

[4]曲 超，胡蘭英，字肖萌，等. 栝樓雌雄株形態(tài)、生理生化指標差異的研究[J]. 種子，2010，29（10）：4-7.

[5]孫永剛. 栝樓苗期雌雄株鑒別的研究[D]. 合肥：安徽大學，2007.

[6]李 珊，程 舟，李 彥，等. 雌雄栝樓植株內含物比較研究[J]. 中草藥，2008，39（2）：260-263.

[7]郭曉亮. 栝樓苗期性別差異及組織培養(yǎng)研究[D]. 武漢：華中農業(yè)大學，2009.

[8]劉 蕓，鐘章成，王小雪，等. 栝樓雌雄植株激素和多胺含量的比較[J]. 園藝學報，2010，37（10）：1645-1650.

[9]劉 蕓，鐘章成，王小雪，等. 栝樓雌雄植株的光合作用和蒸騰作用特性[J]. 應用生態(tài)學報，2011，22（3）：644-650.

[10]張 偉. 栝樓葉片可溶性糖含量的分析比較[J]. 商丘師范學院學報，2012，28（6）：78-81.

[11]劉 偉，方 磊，王 曉，等. 雌雄栝樓天花粉中6種元素次級形態(tài)分析研究[J]. 中藥材，2012，35（3）：421-423.

[12]于鳳池，孫耘子，袁高峰，等. 栝樓性別分化特異大分子標記物研究[J]. 浙江農業(yè)學報，2003，15（6）：332-335.

[13]李彥農. 栝樓性別的分子標記研究[D]. 南京：南京農業(yè)大學，2005.

[14]Kumar S，Singh B D，Sinha D P，et al. Sex expression-associated RAPD markers in pointed gourd（Trichosanthes dioica）[C]//Cucurbitaceae. Proceedings of the Ⅸth Eucarpia Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. Avignon，F(xiàn)rance，2008：543-550.

[15]Seneviratne G. Female sex-associated RAPD marker in pointed gourd（Trichosanthes dioica Roxb.）[J]. Current Science，2002，82（2）：131.

[16]Roy S K，Gangopadbyay G，Ghose K，et al. A cDNA-AFLP approach to look for differentially expressed gene fragments in dioecious pointed gourd（Trichosanthes dioica Roxb.） for understanding sex expression[J]. Current Science，2008，94（3）：381-385.

[17]曲益濤. 栝樓性別轉化的RAPD-SCAR標記研究[D]. 合肥：安徽農業(yè)大學，2010.

[18]Kumar S，Singh B D，Sinha D P. RAPD markers for identification of sex in pointed gourd（Trichosanthes dioica Roxb.）[J]. Indian Journal of Biotechnology，2012，11（3）：251-256.

[19]Nanda S，Kar B，Nayak S，et al. Development of an ISSR based STS marker for sex identification in pointed gourd（Trichosanthes dioica Roxb.）[J]. Scientia Horticulturae，2013，150：11-15.

[20]忻 雅，張延恒，童建新，等. 吊瓜試管苗快繁技術研究及性別驗證[J]. 杭州農業(yè)與科技，2009（2）：35-37.

[21]Zhang W，Wang X，Yu Q，et al. DNA methylation and heterochromatinization in the male-specific region of the primitive Y chromosome of papaya[J]. Genome Research，2008，18（12）：1938-1943.[HT][HJ][FL）]