高原地區(qū)捕食線蟲(chóng)性真菌的分離與鑒定

張洪波+張春霞+孫亞麗+多杰才旦+康明

摘要：采用玉米瓊脂粉培養(yǎng)基對(duì)祁連縣、共和縣和澤庫(kù)縣4個(gè)地區(qū)的不同土壤樣品進(jìn)行捕食線蟲(chóng)性真菌的分離，并利用藏綿羊馬歇爾線蟲(chóng)第3期幼蟲(chóng)誘導(dǎo)真菌捕食器官的產(chǎn)生。結(jié)果表明，從祁連縣土壤樣品中分離到1株捕食線蟲(chóng)性真菌，根據(jù)菌絲及捕食器官的形態(tài)特征，鑒定為少孢節(jié)叢孢菌（Arthrobotrys oligospora）。

關(guān)鍵詞：高原地區(qū)；捕食線蟲(chóng)性真菌；分離鑒定

中圖分類號(hào)：S853.32 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0222-02

真菌是一類具有真正細(xì)胞核、能產(chǎn)生孢子的微小生物，一般都進(jìn)行有性繁殖和無(wú)性繁殖。捕食線蟲(chóng)性真菌是自然界的寶貴資源，廣泛分布于土壤、動(dòng)物糞便、動(dòng)植物殘?bào)w、苔蘚及植物根中，營(yíng)腐生或寄生生活。捕食線蟲(chóng)性真菌在土壤中處于低代謝狀態(tài)，初期營(yíng)腐生生長(zhǎng)，后期由于營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)入捕食階段，把線蟲(chóng)作為主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源或作為腐生生活的補(bǔ)充。目前，已發(fā)現(xiàn)殺線蟲(chóng)性真菌200多種，可分為3種類型：第1類是捕食線蟲(chóng)性真菌，這類真菌能產(chǎn)生捕食線蟲(chóng)性結(jié)構(gòu)（器官）如黏性菌環(huán)（收縮或不收縮）、黏性菌絲、黏性菌網(wǎng)、黏性菌結(jié)等^[1]，通過(guò)捕食性器官捕獲并殺死線蟲(chóng)幼蟲(chóng)^[2-3]，其最大優(yōu)點(diǎn)是對(duì)人和動(dòng)物安全無(wú)害^[4-5]；第2類是內(nèi)寄生性真菌，這類真菌借助分生孢子來(lái)感染線蟲(chóng)，在線蟲(chóng)體內(nèi)生長(zhǎng)形成菌體，消化吸收掉線蟲(chóng)；第3類是包囊體和根瘤線蟲(chóng)寄生性真菌，主要利用營(yíng)養(yǎng)菌絲來(lái)進(jìn)攻線蟲(chóng)蟲(chóng)卵或雌蟲(chóng)。捕食線蟲(chóng)性真菌在自然界中分布最廣泛，其特有的捕食線蟲(chóng)性結(jié)構(gòu)特征明顯，較其他2種類型易于在培養(yǎng)基上進(jìn)行觀察、分離和培養(yǎng)。

寄生蟲(chóng)病嚴(yán)重危害著畜牧業(yè)的發(fā)展，而胃腸道線蟲(chóng)病又是其中一種主要的寄生蟲(chóng)病，分布廣、危害大，造成的畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)損失巨大。目前，對(duì)線蟲(chóng)病的防治主要依賴于化學(xué)藥物。反復(fù)使用同一種化學(xué)藥物易產(chǎn)生抗藥性蟲(chóng)株，還會(huì)造成動(dòng)物性食品的藥物殘留，對(duì)人身體健康帶來(lái)危害，另外，藥物代謝的某些有害成分排出家畜體外，也會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。生物防治因其節(jié)能、環(huán)保、低毒的特點(diǎn)而被人們廣泛研究，國(guó)內(nèi)外普遍重視利用殺線蟲(chóng)性真菌對(duì)寄生蟲(chóng)性線蟲(chóng)病的防治^[6-8]，其中，利用線蟲(chóng)天敵——捕食線蟲(chóng)性真菌^[9]進(jìn)行生物防制研究是最多的。近年來(lái)，我國(guó)在動(dòng)物寄生蟲(chóng)病的生物防治領(lǐng)域研究取得一定的進(jìn)展，楊曉野等對(duì)捕食線蟲(chóng)性真菌的分離、鑒定及生物防治等進(jìn)行了大量研究^[2-4]。但是，對(duì)于高原地區(qū)捕食線蟲(chóng)性真菌的研究及生物防治尚未見(jiàn)報(bào)道。現(xiàn)對(duì)青海省祁連縣、共和縣和澤庫(kù)縣3個(gè)高原地區(qū)的不同土壤樣品，開(kāi)展捕食線蟲(chóng)性真菌的分離和鑒定，為青海省牛羊線蟲(chóng)病的防制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，達(dá)到生物控制牛羊寄生蟲(chóng)病的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 設(shè)備及藥品 隔水式恒溫培養(yǎng)箱；普通顯微鏡；搪瓷盤(pán)；直徑90 mm、高60 mm的玻璃培養(yǎng)皿。瓊脂粉（北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，批號(hào)：20121308）；青霉素（華北制藥股份有限公司，批號(hào)：s1110609）；鹽酸（白銀良友化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：050315）；氫氧化鈉（天津市化學(xué)試劑三廠，批號(hào)：850629）；氯化鈉（北京化工廠，批號(hào)：821212）；新鮮玉米粉（超市購(gòu)買）。

1.1.2 玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA） 稱取新鮮玉米粉40 g，加蒸餾水1 000 mL，微火煮沸1 h，補(bǔ)蒸餾水至1 000 mL，多層紗布過(guò)濾；取濾液5 mL，加蒸餾水495 mL，調(diào)pH值至6.0～6.2，加瓊脂粉20 g，經(jīng)0.68 MPa高壓滅菌20 min后傾注于滅菌玻璃培養(yǎng)皿。

1.1.3 玉米粉瓊脂單抗培養(yǎng)基（SACMA） 配制方法同玉米粉瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)0.68 MPa高壓滅菌20 min后，冷卻至50～60 ℃，每1 mL玉米粉培養(yǎng)基中加入青霉素200 IU，混勻后再傾注于滅菌玻璃培養(yǎng)皿中，備用。

1.1.4 土壤樣品及綿羊糞便的采集 土壤采于青海省祁連縣、共和縣、湟源縣和澤庫(kù)縣4個(gè)地區(qū)，共40份土樣。其中，祁連縣采集10份土樣，土質(zhì)濕潤(rùn)；湟源縣采集3份土樣，土質(zhì)較濕潤(rùn)；日月山采集4份土樣，土質(zhì)干燥；青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物房依次在樹(shù)根、圈口、墻根采集3份土樣，墻根土質(zhì)干燥，其他2份土質(zhì)較濕潤(rùn)；共和縣采集10份土樣，土質(zhì)較濕潤(rùn)；澤庫(kù)縣采集10份土樣，土質(zhì)較濕潤(rùn)。線蟲(chóng)幼蟲(chóng)培養(yǎng)物質(zhì)使用采自青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)的綿羊糞便，利用線蟲(chóng)幼蟲(chóng)培養(yǎng)法得到第3期幼蟲(chóng)備用。

1.1.5 分生孢子洗脫液 取蒸餾水500 mL，加入4.5 g NaCl配成生理鹽水，分裝于250 mL鹽水瓶中，經(jīng)0.68 MPa高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 第3期線蟲(chóng)幼蟲(chóng)的培養(yǎng) 取新鮮羊糞，捏碎后加入少量蒸餾水混勻，捏成山丘狀，放在大平皿中將平皿蓋壓緊，加蒸餾水至平皿2/3處，于25～27 ℃通風(fēng)溫箱中培養(yǎng)5～7 d。從綿羊真胃中挑取馬歇爾屬或奧斯特屬線蟲(chóng)雌蟲(chóng)，從子宮中擠出蟲(chóng)卵，置于每平皿加2～4粒鹽的蒸餾水中，于 25～27 ℃ 通風(fēng)溫箱中培養(yǎng)7～10 d，每隔2～4 h攪動(dòng)1次蟲(chóng)卵。

1.2.2 捕食線蟲(chóng)性真菌的分離鑒定 土壤樣品以“十”字形撒在玉米粉瓊脂平板培養(yǎng)基中，每份土樣接種3皿，并在每個(gè)玉米粉瓊脂平板培養(yǎng)基內(nèi)加入約50條線蟲(chóng)第3期幼蟲(chóng)；將培養(yǎng)皿置于搪瓷盤(pán)內(nèi)，保持一定濕度，在（20±1） ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)，每周用普通顯微鏡觀察1次，并加1次幼蟲(chóng)，誘導(dǎo)真菌捕食器官；在3～5 d后若出現(xiàn)捕蟲(chóng)現(xiàn)象，利用顯微鏡（10×、40×）觀察并拍攝照片，根據(jù)出現(xiàn)捕食線蟲(chóng)的特征性結(jié)構(gòu)菌環(huán)及菌網(wǎng)，參照李天飛等資料^[10]進(jìn)行分類鑒定。

1.2.3 菌株的純化 對(duì)具有捕蟲(chóng)現(xiàn)象的分離菌株，在顯微鏡下用接種環(huán)鉤取，接種到玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上，27 ℃通風(fēng)溫箱培養(yǎng)3～5 d，觀察真菌生長(zhǎng)情況。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)學(xué)特征

分離菌株的菌絲發(fā)達(dá)，呈較密集的絲狀體，菌絲無(wú)色有隔；線蟲(chóng)幼蟲(chóng)存在時(shí)，菌絲上形成菌環(huán)；分離菌株分生孢子梗細(xì)長(zhǎng)、無(wú)色、直立、不分枝，分生孢子圍繞著分生孢子梗輪狀排列生長(zhǎng)，一般在2輪以上，分生孢子在孢子梗頂部密集成簇狀；分生孢子呈倒卵形，形態(tài)豐滿，無(wú)色雙胞，雙胞分隔處向內(nèi)收縮，遠(yuǎn)端（上端）細(xì)胞較大，孢子基部（下部）較尖（圖1）。

參考文獻(xiàn)：

[1]Nansen P，Grnvold J，Henriksen S A，et al. Interactions between the predacious fungus Arthrobotrys oligospora and third-stage larvae of a series of animal-parasitic nematodes[J]. Veterinary Parasitology，1988，26（3/4）：329-337.

[2]楊曉野，楊蓮茹，劉珍蓮，等. 捕食線蟲(chóng)性真菌——少孢節(jié)叢孢菌CIMH1株捕食特性研究[J]. 中國(guó)獸醫(yī)寄生蟲(chóng)病，1999，7（2）：16-19.

[3]楊玉琴，楊曉野，楊蓮茹，等. 少孢節(jié)叢孢菌的生長(zhǎng)特性研究[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科技，1998，28（10）：24-25.

[4]楊蓮茹，楊曉野，楊玉琴，等. 捕食線蟲(chóng)真菌的分離鑒定[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，7（S2）：76-78.

[5]秦澤榮，繆作清，李美子，等. 新鮮牛糞便中食線蟲(chóng)真菌的分離和鑒定[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，21（1）：58-59.

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[9]Cooke R C，Godfrey B . A key to the nematode-destroying fungi[J]. Transactions of the British Mycological Society，1964，47（1）：61-74.

[10]李天飛，張克勤，劉杏忠.食線蟲(chóng)菌物分類學(xué)[M]. 北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，2000.endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)學(xué)特征

分離菌株的菌絲發(fā)達(dá)，呈較密集的絲狀體，菌絲無(wú)色有隔；線蟲(chóng)幼蟲(chóng)存在時(shí)，菌絲上形成菌環(huán)；分離菌株分生孢子梗細(xì)長(zhǎng)、無(wú)色、直立、不分枝，分生孢子圍繞著分生孢子梗輪狀排列生長(zhǎng)，一般在2輪以上，分生孢子在孢子梗頂部密集成簇狀；分生孢子呈倒卵形，形態(tài)豐滿，無(wú)色雙胞，雙胞分隔處向內(nèi)收縮，遠(yuǎn)端（上端）細(xì)胞較大，孢子基部（下部）較尖（圖1）。

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2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)學(xué)特征

分離菌株的菌絲發(fā)達(dá)，呈較密集的絲狀體，菌絲無(wú)色有隔；線蟲(chóng)幼蟲(chóng)存在時(shí)，菌絲上形成菌環(huán)；分離菌株分生孢子梗細(xì)長(zhǎng)、無(wú)色、直立、不分枝，分生孢子圍繞著分生孢子梗輪狀排列生長(zhǎng)，一般在2輪以上，分生孢子在孢子梗頂部密集成簇狀；分生孢子呈倒卵形，形態(tài)豐滿，無(wú)色雙胞，雙胞分隔處向內(nèi)收縮，遠(yuǎn)端（上端）細(xì)胞較大，孢子基部（下部）較尖（圖1）。

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[10]李天飛，張克勤，劉杏忠.食線蟲(chóng)菌物分類學(xué)[M]. 北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，2000.endprint