復(fù)方奧美拉唑膠囊質(zhì)量控制方法的研究

胡晨，鄧紫薇，王旭，房志仲，朱立勤

（1.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津300192；2.天津市第一中心醫(yī)院藥學(xué)部，天津300192；3.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070）

奧美拉唑（o meprazole，OMP） 是一種 H＋－K＋－ATP酶（質(zhì)子泵）抑制劑，OMP與特異性 H＋－K＋－ATP酶有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)胃酸分泌有明顯抑制作用，起效迅速，適用于消化性潰瘍(胃、十二指腸潰瘍)、反流性食管炎和胃泌素瘤[1-2]。該藥作為第一代質(zhì)子泵抑制劑具有療效顯著、復(fù)發(fā)率低、不良反應(yīng)少及服用方便等特點(diǎn)，臨床應(yīng)用廣泛[3]。2006年，由Santarus公司研制、商品名為Zegerid的復(fù)方奧美拉唑膠囊上市，即將OMP與碳酸氫鈉制成復(fù)方制劑，為首個(gè)上市的質(zhì)子泵抑制劑速釋制劑，每粒膠囊中含OMP 20mg與碳酸氫鈉1 100mg，處方中碳酸氫鈉可以保護(hù)OMP不被降解，同時(shí)起到中和胃酸的作用，起效迅速[4]。碳酸氫鈉為吸收性抗酸藥，口服能被吸收而影響體液的酸堿平衡。主要用于治療胃酸過多癥、代謝性酸中毒、與磺胺類藥合用堿化尿液[5]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，筆者研制了該復(fù)方膠囊，并建立了相應(yīng)的質(zhì)控方法，為申報(bào)仿制藥物制劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 美國(guó)高效液相色譜儀Spectra-Physics，檢測(cè)器 Spectra Focus100，輸液泵 SP8810，Anastar色譜工作站；色譜柱TIANHE誖KromasilC18（200 mm×4.6 mm，5μm）；紫外可見分光光度計(jì)（UV－3310，日立公司)；RCZ-8A智能藥物溶出儀（天津市鑫州科技有限公司）；KQ-100B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ALC-210.4型電子分析天平（北京賽多利斯系統(tǒng)儀器有限公司）；80-2B型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器有限公司）；酸度計(jì)PHS-25（數(shù)顯）pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.1.2 試劑 奧美拉唑?qū)φ掌罚ㄖ袊?guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100367-201104）；奧美拉唑原料（湖北遠(yuǎn)誠(chéng)藥業(yè)，批號(hào)：A-10411107001）；復(fù)方奧美拉唑膠囊（本室自制）；甲醇（天津市康科德科技有限公司，色譜純）；乙腈（天津市康科德科技有限公司，色譜純）；其它試劑均為市售分析純；重蒸水（自制）。

1.2 方法

1.2.1 奧美拉唑的質(zhì)量控制方法

1.2.1.1 紫外分光光度法的建立[6～7]

1.2.1.1.1 樣品溶液的制備：（1）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取干燥至恒重的OMP對(duì)照品10mg置100mL量瓶中，加入少量甲醇超聲溶解，再稀釋至刻度。過濾，所得續(xù)濾液作為濃度為100μg/mL儲(chǔ)備液；（2）樣品溶液的制備：取20粒膠囊內(nèi)容物，混勻，研細(xì)后，取 118.7mg（相當(dāng)于 OMP 2mg），置 50 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋，超聲20min，靜置至室溫，用甲醇稀釋定容。取一定量的溶液，離心，3 000 r/min，5min。取上清液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾。取續(xù)濾液2.5mL置10mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋定容，即得樣品溶液；（3）空白溶液的制備：按照制劑處方去除OPM制成空白膠囊，其它操作同樣品溶液的制備過程，得到空白溶液。

1.2.1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密吸取0.2、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.7mL 儲(chǔ)備液于 10mL 的量瓶中，稀釋成 2、5、7.5、10、12.5、15、17 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，以甲醇為空白溶液，測(cè)定其吸光度，計(jì)算回歸方程。

1.2.1.1.3 精密度試驗(yàn)：將OMP對(duì)照品配制成10 μg/mL濃度溶液，用甲醇定容，一天內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次，得日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定6 d，得日間精密度，計(jì)算RSD。

1.2.1.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)：按照“1.2.1.1.1⑵”項(xiàng)下操作，其中一份避光放置，一份不避光，分別在0、3、6、9、12、24 h 測(cè)定其吸光度，計(jì)算 RSD。

1.2.1.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取同一批樣品適量，共6份，分別按照“1.2.1.1.1⑵”項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，在302 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果OPM的RSD=0.66%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

1.2.1.1.6 含量測(cè)定：按照“1.2.1.1.1⑵”項(xiàng)下操作，制備樣品溶液，在302 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算含量。

1.2.1.1.7 回收率試驗(yàn)：精密稱取干燥至恒重的OMP對(duì)照品50mg，于50mL量瓶中，配制成1mg/mL儲(chǔ)備液，分別吸取0.8、1、1.2mL（即處方量80%、100%、120%），分別加入處方量的輔料置50mL棕色量瓶中，用甲醇溶解，超聲振蕩20min后定容至刻度，3 000 r/min離心10min，吸取5mL置10mL棕色量瓶中，照分光光度法在302 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值，并將測(cè)得值與加入值比較，計(jì)算其回收率。

1.2.1.2 HPLC方法的建立[8～9]

1.2.1.2.1 色譜條件的選擇：選用反向硅膠色譜柱TIANHE誖 Kromasil-C18柱（200mm×4.6mm，5μm）為固定相，流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸-三乙胺=60∶40∶0.12∶0.3，流速為 0.8mL/min，柱溫為室溫。

1.2.1.2.2 專屬性試驗(yàn)：分別以流動(dòng)相作溶劑，配制復(fù)方奧美拉唑膠囊的溶液、OMP原料藥溶液及各種輔料的溶液。將所配溶液按照確定色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。

1.2.1.2.3 樣品溶液的制備：⑴對(duì)照品溶液的制備：精密稱取干燥至恒重的OMP對(duì)照品10mg，于50 mL量瓶中，先加入少量流動(dòng)相超聲溶解，再稀釋至刻度，過濾，所得續(xù)濾液作為濃度為200μg/mL儲(chǔ)備液；⑵樣品溶液的制備：按照“1.2.1.1.1⑵”項(xiàng)下操作，即得樣品溶液；⑶空白溶液的制備：按照“1.2.1.1.1⑶”項(xiàng)下操作，得到空白溶液。

1.2.1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取0.1、0.25、0.5、0.75、1.00、1.25、1.50mL 儲(chǔ)備液于 10 mL 的量瓶中，用流動(dòng)相稀釋成 2、5、10、15、20、25、30 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣20μL，記錄峰面積，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

1.2.1.2.5 精密度試驗(yàn)：吸取“1.2.1.2.3項(xiàng)下”儲(chǔ)備液1mL置10mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋，所得溶液按照確定色譜條件同一天內(nèi)平行進(jìn)樣6次，計(jì)算RSD值，得到日內(nèi)精密度。連續(xù)進(jìn)樣6 d，計(jì)算RSD值，得到日間精密度。

1.2.1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液適量，按照“1.2.1.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于制備后 0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣20μL測(cè)定，記錄峰面積。

1.2.1.2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)：精密量取同一批樣品適量，共6份，分別按照“1.2.1.2”項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，按照“1.2.1.2.1”項(xiàng)下色譜條件各取20μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。

1.2.1.2.8 回收率試驗(yàn)：處理方法同“1.2.1.1.1⑵”項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，溶劑由甲醇改成流動(dòng)相。

1.2.1.2.9 含量測(cè)定：取20粒膠囊內(nèi)容物研細(xì)后，取118.7mg（相當(dāng)于OMP 2mg），置50mL棕色量瓶中，用流動(dòng)相稀釋，超聲20min，靜置至室溫，用流動(dòng)相稀釋定容。取一定量的溶液，離心，3 000 r/min、5min。取上清液，用0.45μm微孔濾膜過濾。取續(xù)濾液5mL置10mL棕色量瓶中，用流動(dòng)相稀釋定容，即得樣品溶液。按照“1.2.1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積（A），按照外標(biāo)一點(diǎn)法，計(jì)算濃度，測(cè)定OMP的含量，將其結(jié)果與紫外分光光度法的結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，比較兩種方法是否存在顯著性差異。

1.2.1.2.10 含量均勻度試驗(yàn)：取本膠囊1粒，稱重，精密稱量取所有囊殼內(nèi)細(xì)粉，置于50mL量瓶中，用流動(dòng)相沖洗膠囊殼，沖洗液加入量瓶中，加適量流動(dòng)相稀釋，超聲20min，放冷定容。取一定量的溶液，離心，3 000 r/min、5min。取上清液，用 0.45 μm微孔濾膜過濾。取續(xù)濾液5mL置10mL棕色量瓶中，用流動(dòng)相稀釋定容，即得樣品溶液。按此要求共檢測(cè)10粒。按照上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積（A），按照外標(biāo)一點(diǎn)法，計(jì)算濃度，測(cè)定OMP的含量，應(yīng)符合藥典規(guī)定。

2 結(jié)果

2.1 奧美拉唑?qū)φ掌纷贤夥止夤舛确ǖ慕Y(jié)果

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 由圖1和圖2可以看出，OMP對(duì)照品在302 nm處有最大吸收，且輔料在此波長(zhǎng)處對(duì)主藥的測(cè)定無(wú)干擾，所以確定302 nm為藥物的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 奧美拉唑?qū)φ掌返募状既芙夂土鲃?dòng)相溶解的紫外掃描圖Fig 1 UV spectrum of omeprazole reference inmethanoland in m obilephase

2.1.2 奧美拉唑?qū)φ掌返臉?biāo)準(zhǔn)曲線 以吸光度值（A）對(duì)濃度（C）作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為：y=0.0503x-0.0066，r=0.9998。結(jié)果表明，在2～17μg/mL的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

圖2 空白輔料在碳酸氫鈉水溶液和PBS 6.8中的紫外掃描圖Fig2 UVspectrum ofblankexcipientsinsodium bicarbonatesolution and in PBS 6.8

2.1.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果 日內(nèi)精密度的RSD為0.44%，日間精密度的RSD為0.75%，均小于2%，方法重現(xiàn)性良好，符合要求。

2.1.4 樣品溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果 未避光放置的樣品溶液在9 h時(shí)測(cè)量其吸光度值降低，而采取避光處理的樣品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性符合要求，RSD<2%，提示奧美拉唑見光易降解，需要避光保存。見表1。

表1 奧美拉唑樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)（n=12）Tab1 Stability of omeprazole sampleby theUV analysis（n=12）

2.1.5 回收率試驗(yàn)結(jié)果 方法回收率為98%～102%，RSD<2.0%，符合規(guī)定。證明在高、中、低3個(gè)濃度范圍內(nèi)，本處方輔料不影響OMP的測(cè)定，該方法具有良好準(zhǔn)確度。見表2。

2.2 奧美拉唑HPLC測(cè)定結(jié)果

2.2.1 專屬性試驗(yàn)結(jié)果 分別取“1.2.1.2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各20μL，按照“1.2.1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果表明，OPM的保留時(shí)間約12min，陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾。色譜見圖3～4。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab2 Resultsof recovery test（n=9）

圖3 奧美拉唑原料藥HPLC色譜圖Fig 3 HPLC chrom atogram sof om eprazole

圖4 空白輔料HPLC色譜圖Fig 4 HPLC chrom atogram sof blank

2.2.2 奧美拉唑的標(biāo)準(zhǔn)曲線 以峰面積(A)對(duì)濃度（C）做線性回歸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為A＝71 627C-9 783，r=0.999 9（n＝3），結(jié)果表明，OMP 在 2～30 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.2.3 精密度結(jié)果 日內(nèi)精密度的RSD為0.60%，日間精密度的RSD為0.56%，均小于2%，方法重現(xiàn)性良好，符合要求。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 OPM樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD 為 0.54%（n＝12），OMP 避光保存在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果 OPM的RSD為0.66%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.6 回收率試驗(yàn)結(jié)果 OMP的回收率為98.00%～102.00%，RSD均小于2%，符合規(guī)定，見表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab3 Resutsof recory test（n＝9）

2.2.7 含量測(cè)定結(jié)果 測(cè)得3個(gè)批次復(fù)方奧美拉唑膠囊中OMP的平均含量為99.36%，RSD為0.57%。根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》（二部）規(guī)定，OMP含量應(yīng)在90.00%～110.00%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%，符合要求。

2.2.8 含量均勻度試驗(yàn)結(jié)果 復(fù)方奧美拉唑膠囊中：A+1.80S 為 2.17＜15.0，符合規(guī)定，見表 4。

表4 復(fù)方奧美拉唑膠囊的含量均勻度（n=10）Tab4 The content uniform ity of com pound omeprazole capsules（n＝10）

3 討論

3.1 超聲時(shí)間的確定 取6粒樣品研細(xì)后，取118.7mg置50mL量瓶中，加入流動(dòng)相，分別超聲5 min、10min、20min，靜置，用流動(dòng)相稀釋定容。取一定量的溶液，離心5min，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min。取上清液，用0.45μm微孔濾膜過濾。分別吸取續(xù)濾液5mL至10mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋定容，即得樣品溶液，分別進(jìn)樣，計(jì)算結(jié)果表明：超聲20min的復(fù)方奧美拉唑膠囊中OMP的含量高于其他兩種方法，因此選擇超聲20min的提取方法。

3.2 色譜條件的選擇 不同流動(dòng)相比例的考察：分別配制甲醇-水-磷酸-三乙胺=61∶39∶0.12∶0.3，甲醇-水-磷酸-三乙胺=62∶38∶0.12∶0.3，甲醇-水-磷酸-三乙胺=59∶41∶0.12∶0.3 不同比例的 3 種流動(dòng)相，分別精密量取對(duì)照品20μL進(jìn)樣，流速均為0.8mL/min，觀察OMP的出峰情況。含量測(cè)定結(jié)果顯示，流動(dòng)相的比例和流速有微小的變動(dòng)對(duì)其幾乎沒有影響，說明本方法耐用性良好。

3.3 紫外分光光度法和HPLC法比較 兩種質(zhì)量控制方法的結(jié)果通過t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P值均＞0.05，說明兩種方法無(wú)顯著性差異，由于雜質(zhì)及有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的需要，所以首選HPLC法，紫外分光光度法可以作為溶出度結(jié)果的考察方法。

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