黃芪介導(dǎo)PGC-1α/Nrf2通路對年齡相關(guān)聽力損失保護(hù)作用的研究?

謝 慧，趙小君，張玉簫，鄧新星

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610075 ，2.四川省建筑醫(yī)院，成都 610081，3.四川青白江區(qū)中醫(yī)院，成都 610300)

在我國，大約有45%以上的60歲人群患有不同程度的聽力障礙，老年人的聽力健康日益引起全社會的關(guān)注[1]，探索老年性耳聾發(fā)病機(jī)制和防治措施的研究亦顯得尤為重要。氧化應(yīng)激是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，并被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老以及年齡相關(guān)聽力損失的一個重要因素[2，3]。隨著年齡的增長，體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平增加，而內(nèi)耳組織過氧化會促進(jìn)耳蝸組成細(xì)胞DNA損傷，繼而引發(fā)耳內(nèi)耳細(xì)胞如外毛細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致聽力衰退[4，5]。中醫(yī)對抗衰老早有認(rèn)識，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有抗衰老的精辟論述：“上古之人，其知道者，法于陰陽，和于術(shù)數(shù)，食飲有節(jié)，起居有常，不妄作勞，故能形與神俱，而盡終其天年，度百歲乃去。[6]”經(jīng)過長期的實踐，中醫(yī)發(fā)現(xiàn)多種有抗衰老作用的中藥。黃芪作為一種常見的中藥材，具有擴(kuò)張冠狀動脈、改善心肌供血、提高免疫功能、延緩細(xì)胞衰老進(jìn)程的功效，其分子機(jī)制與抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激有關(guān)[7，8]。但是黃芪與年齡相關(guān)聽力損失之間的關(guān)系尚不得知。本研究在快速衰老小鼠模型上探究黃芪對年齡相關(guān)的聽力損失的影響及其分子機(jī)制。本研究通過成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批號201912001)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級6周齡雄性SAMP8小鼠48只，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號SCXK(京)2019-0004。小鼠飼養(yǎng)于溫度22±2 ℃、相對濕度40%～60%的環(huán)境中，適應(yīng)2周后隨機(jī)分為對照組和治療組各24只。對照組小鼠給予正常飲用水，治療組小鼠全程給予含有黃芪(40 mg/mL)的飲用水，每只鼠每天攝入黃芪劑量約10 mg/kg(黃芪抗衰老實驗研究常用劑量10 mg/kg～40 mg/kg，因本實驗為長期給藥，故選擇小劑量)，連續(xù)飲用6個月，小鼠飼養(yǎng)在相同環(huán)境中。

1.2 主要試劑與儀器

黃芪注射液(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z13020999)；Alex Fluor-594標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽、SYBR Green qPCR預(yù)混液(賽默飛世爾科技(中國)有限公司，貨號A12381、K0251)；8-OhdG熒光染色試劑盒(中國艾美捷科技有限公司，貨號P-6004-96)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(中國凱基生物科技有限公司，貨號KGA105)；活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondiadehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒(中國碧云天生物技術(shù)研究所，貨號S0033 S、S0131 S、S0086)；活化的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase，cleaved PARP)-1、活化的半胱氨酸蛋白酶(cleaved cysteine protease，cleaved caspase)-3、過氧化物酶體增殖物活化受體協(xié)同刺激因子1α(peroxisome proliferator activated receptor costimulator factor 1α,PGC-1α)、核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)、GAPDH、細(xì)胞核內(nèi)參Lamin b1抗體(英國Abcam公司，貨號ab32064、ab214430、ab191838、ab8245、ab31163、ab133741)。

MB11型小動物聽覺腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)測試系統(tǒng)，德國MAICO公司；Axiolab 5型熒光顯微鏡，德國ZEISS公司；CFX96 Touch型熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；ChemiDocTMMP型全能型成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.3 ABR閾值測量

分別于治療前，與治療1、2、4、6個月取2組小鼠，每組24只，使用戊巴比妥(80 mg/kg)麻醉小鼠，置于恒溫墊上維持體溫37℃，將電極插入頭頂皮下、耳廓后方乳突皮下及尾部皮下，利用小動物ABR測試系統(tǒng)對小鼠進(jìn)行click及4、8、16及32 Hz短純音刺激獲取ABR，在每個刺激水平收集512個響應(yīng)。最后一次ABR閾值測量之后斷頸處死小鼠，取小鼠耳蝸組織，對耳蝸組織中細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激及炎癥相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測。

1.4 外毛細(xì)胞染色、8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy deoxy guanosine,8-OHdG)染色及TUNEL染色

治療6個月后取2組小鼠耳蝸每組各8只，依次使用20%、30%濃度蔗糖對耳蝸組織進(jìn)行脫水，OCT包埋，使用冰凍切片機(jī)制備8 μm厚度的冰凍切片，95%乙醇固定20 min，山羊血清室溫封閉1 h，進(jìn)行外毛細(xì)胞染色、8-OHdG染色及TUNEL染色。外毛細(xì)胞染色：將PBS稀釋的Alex Fluor-594標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(1∶1000)滴注在切片組織上，室溫孵育1 h，PBST洗滌后使用熒光顯微鏡觀察外毛細(xì)胞形態(tài)并任選5個視野拍照，計算耳蝸外毛細(xì)胞個數(shù)和有完整“V”字形的毛細(xì)胞個數(shù)。8-OhdG染色：使用8-OhdG熒光染色試劑盒對組織中8-OhdG含量進(jìn)行染色，具體方法參照說明書。外毛細(xì)胞TUNEL染色：使用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒對小鼠耳蝸組織中細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測，具體方法參照試劑盒說明書。8-OhdG染色和TUNAL染色結(jié)束后使用上述熒光顯微鏡并任選5個視野拍照，統(tǒng)計每個視野中陽性細(xì)胞面積。

1.5 ROS、MDA、SOD的ELISA檢測

治療6個月后取2組小鼠耳蝸每組各8只，使用RIPA裂解液對組織進(jìn)行裂解，取上清液使用ROS、MDA、SOD ELISA檢測試劑盒對耳蝸組織中ROS、MDA含量以及SOD活性進(jìn)行檢測，具體方法參照說明書。

1.6 熒光定量PCR

治療6個月后取2組小鼠耳蝸各8只，采用Trizol法提取耳蝸組織中RNA，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。熒光定量PCR儀檢測耳蝸組織中抗氧化分子G6pdh、GCL-c、Gpx-1、Sod2 mRNA表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算各樣本mRNA 的表達(dá)水平。G6pdh引物：上游5′-CAGGCAGAGACTTTACGATG-3′，下游5′-CCAACTGGAGCTTGGAAATG-3′；GCL-c引物：上游5′-CGTCAGTGGAGGCTTCATAG-3′，下游5′-CTGAGGCTGAATGGTTCACA-3′；Gpx-1引物：上游5′-AGACGACTGAGCTTTAAGGC-3′，下游5′-GAA CTTCACCTGGATGAGGA-3′；Sod2引物：上游5′-CTCAGGGGCAGAGTTAGTTC-3′，下游5′-GATGAG CTGATTCACTGGCA-3′；GAPDH引物：上游5′-ACTC GGAGGGCAGTTCGTTA-3′，下游5′-GAGATTTGT CAAGCCGCATG-3′；白細(xì)胞介素(interleukin,IL)1β引物：上游5′-CGAGAGGATGTTCCAATGCA-3′，下游5′-GTTCTGCAAACTGGCAGGAA-3′；IL-6引物：上游5′-GACGAGAGCCAGTTTAGCAT-3′，下游5′-TGGAGCTTCACTGGAAGACA-3′；腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α引物：上游5′-GGAGGCGCTAATTCGTTAGC-3′，下游5′-CCTTG GGGATGATACACATG-3′。其中健康ICR小鼠作為空白對照；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.7 Western blotting檢測

治療6個月后取2組小鼠耳蝸每組各8只，使用RIPA裂解液進(jìn)行裂解，離心后取上清液保存于-20 ℃?zhèn)溆?。SDS-PAGE跑膠、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉，cleaved PARP-1(1∶1000)、cleaved caspase-3(1∶1000)、PGC-1α(1∶1000)、Nrf2(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)、Lamin b1(1∶1000)一抗4 ℃孵育12 h，HRP標(biāo)記的二抗37 ℃孵育1 h，加入ECL發(fā)光液曝光檢測，其中GAPDH是胞漿蛋白內(nèi)參蛋白，Lamin b1是核蛋白內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 黃芪治療對小鼠年齡相關(guān)聽力損失的影響

治療6個月后當(dāng)ABR測試使用click刺激時，治療組小鼠的ABR閾值與對照組比較顯著降低，且在8、16、32 kHz短純音的刺激下，治療組ABR閾值與對照組比較均顯著降低(P<0.01)(見圖1)。

注：A.各組小鼠對click刺激的ABR的原始痕跡；B.各組小鼠對click刺激的ABR閾值；C.各組小鼠在不同頻率短純音刺激下的ABR閾值；與對照組比較：**P<0.01圖1 黃芪治療對小鼠年齡相關(guān)聽力損失的影響

2.2 黃芪治療對小鼠耳蝸外毛細(xì)胞的影響

治療組外毛細(xì)胞損失數(shù)量、凋亡細(xì)胞數(shù)量及耳蝸組織中cleaved PARP-1和cleaved caspase 3水平與對照組比較顯著減少(P<0.01)(見圖2)。

注：A.鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果；B.損傷外毛細(xì)胞占的比例；C.外毛細(xì)胞TUNEL染色結(jié)果；D.凋亡的外毛細(xì)胞所占面積；E-F.耳蝸組織cleaved PARP-1和cleaved caspase 3的蛋白表達(dá)水平；與對照組比較：**P<0.01圖2 黃芪治療對增齡引發(fā)外毛細(xì)胞損傷的影響

2.3 黃芪治療對小鼠外毛細(xì)胞DNA損傷的影響

治療組8-OhdG的含量與對照組比較顯著降低(P<0.01)(見圖3)。

注：A.8-OhdG染色結(jié)果；B.8-OhdG陽性區(qū)域面積；與對照組比較：**P<0.01圖3 黃芪治療對增齡引發(fā)外毛細(xì)胞DNA損傷影響比較

2.4 黃芪治療對小鼠外耳蝸組織中氧化應(yīng)激水平的影響

治療組耳蝸組織中ROS、MDA水平與對照組比較顯著降低，而SOD活性與對照組比較顯著升高(P<0.01)(見表1)。

表1 各組小鼠耳蝸組織中ROS、MDA及SOD活性比較

2.5 黃芪治療對小鼠外耳蝸組織中抗氧化基因表達(dá)的影響

治療組耳蝸組織中G6pdh、GCL-c、Gpx-1、Sod2 mRNA表達(dá)水平與對照組比較顯著升高(P<0.05，P<0.01)(見表2)。

表2 各組小鼠耳蝸組織G6pdh、GCL-c、Gpx-1、Sod2 mRNA表達(dá)水平比較

2.6 黃芪治療對小鼠外耳蝸組織中細(xì)胞因子表達(dá)的影響

熒光定量PCR結(jié)果顯示，治療組耳蝸組織中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)水平較對照組顯著降低(P<0.05)(見表3)。

表3 各組小鼠耳蝸組織白細(xì)胞介素IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平比較

2.7 黃芪治療對小鼠外耳蝸組織中PGC-1α/Nrf2通路的影響

治療組耳蝸組織中PGC-1α表達(dá)水平以及Nrf2的核積累量相比于對照組顯著升高(P<0.01)(見圖4)。

注：A.耳蝸組織中PGC-1α表達(dá)以及Nrf2核積累的western blotting檢測；B.PGC-1α表達(dá)以及Nrf2核積累量灰度分析結(jié)果；與對照組比較：**P<0.01圖4 黃芪治療對耳蝸組織中過氧化物酶體增殖物活化受體協(xié)同刺激因子(peroxisome proliferator activated receptor costimulator factor,PGC)1α表達(dá)以及核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor E2 related factor,Nrf)2核積累的影響

3 討論

隨著老齡化社會的來臨，年齡相關(guān)性聽力損失的防治與治療已成為當(dāng)今社會研究的熱點。衰老氧化應(yīng)激被認(rèn)為是促進(jìn)衰老以及年齡相關(guān)性聽力損失的重要因素。一方面當(dāng)機(jī)體發(fā)生衰老時，內(nèi)耳骨膜會增厚，繼而壓迫內(nèi)耳道底部神經(jīng)血管通道，導(dǎo)致通道變小，使耳蝸內(nèi)耳血流量減少，導(dǎo)致耳蝸缺氧和聽力損失[9]。另一方面，人體耳蝸是氧代謝的活躍組織，隨著組織器官的老化，耳蝸毛細(xì)胞的抗氧化能力逐漸下降，耳蝸整體趨向過氧化狀態(tài)，然后每當(dāng)耳蝸發(fā)生大量的過量氧化反應(yīng)時，耳蝸組織會產(chǎn)生大量的氧自由基，過量氧自由基最終導(dǎo)致耳蝸組織細(xì)胞的氧化性衰老，衰老細(xì)胞中的色素C氧化酶活性下降，繼而線粒體功能受損，導(dǎo)致耳蝸能力供給不足，最終導(dǎo)致聽力損失[9]。因此，改善機(jī)體氧化應(yīng)激水平是緩解年齡相關(guān)性聽力損失的重要途徑。黃芪是傳統(tǒng)中藥材中最重要的益氣適生藥材之一，其主要成分是多糖、黃酮類化合物和皂苷。研究表明，黃芪在抗衰老以及衰老相關(guān)疾病方面具有顯著效果[8,10]。

SAMP8小鼠是一種快速衰老模型，研究表明SAMP8小鼠衰老過程會伴隨顯著的聽力下降[11]。因此，本研究采用快速衰老模型SAMP8小鼠觀察黃芪對年齡相關(guān)性聽力損失的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪干預(yù)能明顯降低小鼠的ABR閾值。耳蝸外毛細(xì)胞頂端的纖毛是機(jī)械信號的接受器，含有重要的離子通道，在耳朵行使聽力功能時具有重要作用。外毛細(xì)胞上含大量肌動蛋白，本研究通過使用鬼筆環(huán)肽染色發(fā)現(xiàn)，黃芪干預(yù)能夠顯著降低外毛細(xì)胞損失比例。近年研究發(fā)現(xiàn)，耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退變是衰老的主要表現(xiàn)，而退變的主要形式是毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，凋亡信號通路涉及許多分子和蛋白[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪干預(yù)能夠顯著減少凋亡外毛細(xì)胞數(shù)目，且能抑制耳蝸組織中caspase 3凋亡通路的激活。這些結(jié)果表明，黃芪能夠通過抑制耳蝸外毛細(xì)胞凋亡緩解年齡相關(guān)性聽力損失，

氧化應(yīng)激是細(xì)胞凋亡的重要分子機(jī)制，當(dāng)機(jī)體的氧化應(yīng)激平衡被打破，機(jī)體處于過氧化狀態(tài)，機(jī)體的氧自由基ROS等會通過損傷線粒體[13]、激活細(xì)胞死亡受體以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。8-OHdG是活性氧自由基如羥自由基、單線態(tài)氧等攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子而產(chǎn)生的一種氧化性加合物，能夠作為內(nèi)源性及外源性因素對DNA氧化損傷作用的生物標(biāo)志物，通過8-OHdG的檢測可以評估體內(nèi)氧化損傷和修復(fù)的程度，及氧化應(yīng)激與DNA損傷的相互關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪治療顯著降低外毛細(xì)胞中8-OHDG含量，表明黃芪干預(yù)能夠顯著抑制外毛細(xì)胞氧化應(yīng)激引發(fā)的DNA損傷。ROS、MDA是機(jī)體氧化應(yīng)激及損傷的標(biāo)記物，SOD活性及G6pdh、GCL-c、Gpx-1、Sod2分子表達(dá)量反映機(jī)體的抗氧化水平[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪干預(yù)顯著改善耳蝸組織炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為降低IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平。PGC-1α是維持線粒體生物合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，主要存在于線粒體豐富的組織或器官中，可促進(jìn)線粒體生物合成，增強(qiáng)不同組織細(xì)胞有氧呼吸功能，且在能量平衡、線粒體氧化代謝等方面發(fā)揮重要作用[15]。Nrf2是一種重要的氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子，其通過誘導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)抗氧化分子的表達(dá)，有利于改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞存活以及維持細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)[16]。

綜上所述，黃芪能夠抑制耳蝸毛細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而改善年齡相關(guān)的聽力損失，其分子機(jī)制與激活PGC-1α/Nrf2通路抑制耳蝸組織中氧化應(yīng)激水平有關(guān)，本研究為臨床應(yīng)用黃芪預(yù)防和治療年齡相關(guān)聽力損失提供了實驗依據(jù)。