耐熱木聚糖酶源細(xì)菌篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)

謝鳳珍,華承偉,牛宏陽

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

木聚糖是自然界中含量?jī)H次于纖維素的第二大類多糖,是半纖維素中含量最豐富的一種,占地球可再生有機(jī)碳的三分之一[1].木聚糖主鏈?zhǔn)怯啥鄠€(gè)β-D-吡喃木糖基通過β-1,4-糖苷鍵連接的復(fù)雜分子多聚糖,它的存在使谷物中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能被充分暴露于動(dòng)物消化液的表面,進(jìn)而影響動(dòng)物的消化吸收,降低了飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2-3].木聚糖酶（xylanase,EC3.2.1.8）主要以內(nèi)切方式作用于木聚糖主鏈上的β-1,4-糖苷鍵,水解生成以木二糖為主的低聚糖[4],它在生物轉(zhuǎn)化、食品、飼料、醫(yī)藥、能源、造紙、紡織等行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用[5-7].耐熱木聚糖酶菌株的篩選是木聚糖酶研究的一個(gè)熱點(diǎn),對(duì)該酶的開發(fā)與研究在解決工業(yè)用酶制劑容易熱失活、保存穩(wěn)定性差的缺陷方面具有重要的意義[8].本試驗(yàn)對(duì)篩選得到的耐熱產(chǎn)木聚糖酶菌株Bacillus megaterium FLH-2的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步探究.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源 河南新鄉(xiāng)周邊土壤、太行山南麓叢林土壤及腐殖質(zhì).

1.1.2 培養(yǎng)基

篩選及分離培養(yǎng)基/（g/L）：NH4Cl 1.0,（NH4）2SO41.0,K2HPO40.1,CaCl20.4,MgSO4·7H2O 0.1,玉米芯木聚糖1.0,瓊脂粉15,NaOH調(diào)pH至7.2.

發(fā)酵培養(yǎng)基/（g/L）：蛋白胨10,酵母粉10,玉米芯（過60目篩）20,K2HPO41.0,MgSO4·7H2O 0.3,CaCl20.4,FeSO4·7H2O 0.1.

1.1.3 試劑 酵母提取物、胰蛋白胨（Oxoid公司）,櫸木木聚糖（Sigma公司）,玉米芯木聚糖（自制）,其他試劑均為分析純.

1.1.4 主要儀器 BIOLOG自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（美國(guó)Biolog有限公司）,722型分光光度計(jì)（上海青華科技儀器有限公司）.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)酶菌株分離 分別取土樣及腐殖質(zhì)1 g左右,加入裝有10 mL滅菌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液的小三角瓶中,室溫振蕩30 min,取0.1 mL涂布篩選平板,倒置,于50℃培養(yǎng)2～3 d.用滅菌牙簽挑取單菌落,轉(zhuǎn)接于分離培養(yǎng)基進(jìn)行單菌落分離.

1.2.2 產(chǎn)酶菌株復(fù)篩 用接種針挑取單菌落,接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,200 r/min,50℃培養(yǎng)2 d.取發(fā)酵液1 mL,10 000 r/min離心5 min,取上清,按“1.2.3”的方法測(cè)定酶活,取酶活最高的菌株進(jìn)行菌種鑒定.

1.2.3 酶活測(cè)定 取1.0 mL櫸木木聚糖溶液與經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液0.1 mL混合,反應(yīng)10 min后,沸水煮沸10 min中止反應(yīng),以木糖等作標(biāo)準(zhǔn),酶活力通過DNS測(cè)定還原糖法進(jìn)行[9].酶活力的單位定義為：50℃,pH 6.0的磷酸緩沖液（50 mmol/L）及櫸木木聚糖溶液質(zhì)量濃度為1 g/L的條件下,每min生成1 μmol還原糖所需要的酶量.

1.2.4 菌種初步鑒定 采用美國(guó)Biolog公司GenⅢ生化鑒定板進(jìn)行鑒定：經(jīng)33℃平板培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)的菌種,于超凈工作臺(tái)中用棉簽點(diǎn)取純種的單個(gè)菌落至接種液IF3中,制備透光率在90%～95%的菌懸液,用8道移液器,按每孔100 μL的量加到GenⅢ板的所有微孔中,置于33℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔4 h觀察微孔板中的顏色變化,待其顏色變化較明顯時(shí)用Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行掃描分析,并與Biolog數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)相比較.

1.2.5 粗酶的制備 在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,發(fā)酵液經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為40%和60%的硫酸銨分段鹽析,沉淀重溶于蒸餾水,經(jīng)過夜透析后,10 000 r/min冷凍離心10 min,取上清,即為粗酶樣品.

1.2.6 最適pH與最適溫度測(cè)定 分別測(cè)定粗酶液在pH 2.5～11.0的4種不同緩沖液（50 mmol/L,檸檬酸緩沖液pH 2.5～5.5,MES緩沖液pH 5.0～7.0,磷酸緩沖液pH 6.0～8.5,甘氨酸-NaOH緩沖液pH 8.5～11.0）中的酶活,以最高酶活作為100%；分別于30～90℃測(cè)定酶活,以最高酶活作為100%.結(jié)果為3次重復(fù)的平均值.

1.2.7 pH和溫度穩(wěn)定性測(cè)定 取適量的酶樣品分別于1.5 mL離心管中與不同pH值的緩沖液混勻,水浴鍋中25℃保溫30 min,立即置于4℃水浴中復(fù)性20 min；另取適量酶樣品于1.5 mL離心管中于不同溫度下保溫30 min,立即置于4℃水浴中復(fù)性20 min.酶樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后按“1.2.3”的方法測(cè)定酶活,以最高酶活作為100%.結(jié)果為3次重復(fù)的平均值.

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選與鑒定

經(jīng)含單一碳源的木聚糖篩選平板和50℃篩選,共篩選得到產(chǎn)木聚糖酶真菌菌株12株,經(jīng)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,發(fā)現(xiàn)1株細(xì)菌產(chǎn)酶活較高,可達(dá)624 U/mL,暫命名為XynB2.該菌株在40～55℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好,最適生長(zhǎng)溫度50℃左右.菌落圓形,表面粗糙不透明,污白色（見圖1）.經(jīng)Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)GenⅢ生化鑒定板培養(yǎng)生化結(jié)果進(jìn)行掃描分析,掃描結(jié)果與Biolog數(shù)據(jù)庫(kù)中的巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium相似度達(dá)98%,初步命名該菌為B.megaterium FLH-2.

圖1 菌株XynB2菌落Fig.1 Colony morphologof XynB2

2.2 酶性質(zhì)分析

2.2.1 木聚糖酶最適pH和pH穩(wěn)定性 木聚糖酶最適pH和pH穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果見圖2.

圖2 木聚糖酶最適pH和pH穩(wěn)定性Fig.2 The optimal and stability pH of xylanase from Bacillus megaterium FLH-2

由圖2可知,該芽孢桿菌所產(chǎn)木聚糖酶最適pH約為6.0（圖2（a））,在pH 5.0～7.0之間,相對(duì)酶活可達(dá)最高酶活的80%以上.在pH 5.0～9.0之間,處理30 min,相對(duì)酶活仍可保持80%以上（圖2（b））,說明該酶具有較寬范圍的pH穩(wěn)定性.

2.2.2 木聚糖酶最適溫度和溫度穩(wěn)定性 木聚糖酶最適溫度和溫度穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果見圖3.

圖3 木聚糖酶最適溫度和溫度穩(wěn)定性Fig.3 The optimal and stability thermoof xylanase from Bacillus megaterium FLH-2

由圖3可知,該芽孢桿菌所產(chǎn)木聚糖酶最適作用溫度約為65℃（圖3（a））,高于80℃,酶活顯著降低.在30～75℃之間,相對(duì)酶活可達(dá)最高酶活的80%以上（圖3（b））,表明該木聚糖酶有較寬的溫度作用范圍和良好的耐熱性.

3 結(jié)論

從新鄉(xiāng)周圍土樣及腐殖質(zhì)篩選得到1株產(chǎn)耐熱木聚糖酶的巨大芽孢桿菌B.megaterium FLH-2,其最適生長(zhǎng)溫度50℃,在40～55℃之間,生長(zhǎng)良好.巨大芽孢桿菌生長(zhǎng)溫度一般在3～45℃,最適溫度為30℃,只有極少數(shù)可在63℃生存[10-11],這就為耐熱酶的產(chǎn)生提供了條件.

該菌株所產(chǎn)木聚糖酶最適pH和溫度分別為6.0和65℃,在pH 5.0～9.0之間、溫度低于75℃條件下,相對(duì)酶活可達(dá)最高酶活的80%以上.目前報(bào)道的該菌所產(chǎn)木聚糖酶一般為耐堿性酶[12],而本研究中該菌所產(chǎn)木聚糖酶同時(shí)具有良好的耐酸性,表明該木聚糖酶可很好地應(yīng)用于食品及飼料工業(yè)中.

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