雙水相法和微波法提取假酸漿中總黃酮及純化

張 慧，王 遂

(哈爾濱師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，哈爾濱150025)

假酸漿又名鞭打繡球，為茄科草本植物，是一種中草藥.其全草可入藥，有鎮(zhèn)靜、祛痰、清熱、解毒、止咳功效，對精神病、狂犬病、感冒、風(fēng)濕痛、疥癬等癥有很好的治療作用.種子亦可入藥，名為假酸漿籽.具有清熱退火、利尿、祛風(fēng)、消炎等功效，可治療發(fā)燒、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、瘡癰腫痛等癥［1］.假酸漿也具有食用價(jià)值，是制作涼粉(又稱冰粉)的原料.將假酸漿種子用水浸泡足夠時間后，濾去種子，加適量的凝固劑，凝固一段時間后便制成了晶瑩剔透、口感涼滑的涼粉，是一種消炎利尿、消暑解渴的夏季保健食品.

目前，國內(nèi)關(guān)于假酸漿中總黃酮的提取方法只有浸漬法［2］.這種方法提取的總黃酮含量較低，而且存在原材料利用率低、提取過程周期比較長、溶劑消耗大、提取效率低等缺點(diǎn)，因此急需一些高效低耗的新方法來取代這種高耗低效的提取方式.本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助雙水相萃取法和超聲波微波法等兩種方法提取假酸漿中的總黃酮，實(shí)現(xiàn)了提取方法的突破和創(chuàng)新.超聲波輔助雙水相提取法將超聲波提取和丙醇－硫酸銨雙水相體系提取進(jìn)行集成，使超聲波法良好的提取效果與醇－鹽雙水相水體系高效的分離作用相結(jié)合，將提取與分離兩個過程合二為一，該方法提取率高、提取時間短、產(chǎn)物純度高、操作簡便、高效低耗［3－7］;超聲波微波法是將超聲和微波兩種提取方法進(jìn)行結(jié)合，先通過超聲輔助萃取，再利用微波磁控管所產(chǎn)生的超高頻率的震動，使假酸漿內(nèi)分子間產(chǎn)生強(qiáng)烈碰撞和擠壓，在分子破壁和結(jié)構(gòu)松散后使黃酮迅速浸出［8－9］.超聲波微波法具有操作簡單、反應(yīng)時間短、選擇性好、提取效率高等優(yōu)點(diǎn).

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 材料與試劑

材料假酸漿籽(景東銀生農(nóng)副產(chǎn)品有限公司);無水乙醇(中加化工有限公司);標(biāo)準(zhǔn)品為蘆丁(上?；瘜W(xué)試劑公司);三氯化鋁;HPD－500、AB－8、D101型大孔吸附樹脂(滄州寶恩化工有限公司);大孔樹脂 CAD40、DM130、D1300、DA201;聚酰胺(安徽省三星樹脂有限公司).

1.2 儀器與設(shè)備

752型紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);SHB－II循環(huán)水真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);SHA－C水浴恒溫震蕩器(上海醫(yī)療器械五廠);MP－200A型電光分析天平(上海第二天平儀器廠);SWQ－IA智能數(shù)字恒溫控制器(南京桑力電子設(shè)備廠);DGH－9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司);超聲波清洗器(KQ2200DB);格蘭仕微波爐(WD900SL23－2).

2 方法與結(jié)果

2.1 超聲波輔助雙水相法

2.1.1 析相鹽的選擇

研究表明［8－10］，丙醇能與水無限互溶，當(dāng)在丙醇－水體系中加入某種析相鹽后可形成雙水相溶液.當(dāng)丙醇與水相體積之比不同時，分相所需的析相鹽的量不同.常用的析相鹽有硫酸銨、硫酸氫二鉀、磷酸鈉等.本實(shí)驗(yàn)選擇廉價(jià)、室溫溶解度高、溫度效應(yīng)低的硫酸銨作為配制雙水相溶液的析相鹽.

2.1.2 提取與分離

準(zhǔn)確稱取假酸漿1 g放于100 mL錐形瓶中，加入10 mL石油醚，超聲輔助提取20 min以除去假酸漿中脂溶性成分，過濾，將濾渣在常溫下?lián)]發(fā)干燥以除去殘存的石油醚.

配制雙水相溶液30 mL，加入10.5 g硫酸銨.將去完脂溶性成分的假酸漿粉末加入雙水相溶液中，通過改變單因素醇水比(0.4、0.5、0.6、0.7)，硫酸銨質(zhì)量濃度(7.5、9.0、10.5、12 g/mL)，超聲萃取時間(20、30、40、50 min)，料液比(0.027、0.033、0.040、0.047)來考察影響總黃酮提取率的因素條件.再通過正交實(shí)驗(yàn)確定最佳提取條件.

2.1.3 結(jié)果與分析

選擇醇－水比、硫酸銨質(zhì)量濃度、超聲時間和料液比四種因素進(jìn)行正交試驗(yàn).根據(jù)表1正交試驗(yàn)所得的最佳條件為醇水比0.4，硫酸銨質(zhì)量濃度0.25 g/mL，超聲時間 30 min，料液比 0.047.在最佳條件下得到總黃酮提取率最高，提取率為3.79%.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.2 超聲波微波法

2.2.1 提取

準(zhǔn)確稱取粉碎后的假酸漿粉末4 g，按固液比1∶25加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液，提取溫度為50℃，預(yù)浸時間為10 min，在不同單因素下通過改變超聲溫度(40、45、50、55、60 ℃)，超聲作用時間(5、10、15、20、25 min)，微波功率(小火、中火、中高火、高火)，微波作用時間(30、60、90、120、150 s)，固液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40)等條件進(jìn)行提取，考察影響假酸漿中總黃酮提取率的因素條件，通過正交試驗(yàn)確定最佳提取條件.

2.2.2 結(jié)果與分析

根據(jù)表2正交試驗(yàn)所得的最佳條件為微波輻射功率中火、微波輻射時間60 s、固液比1∶25、超聲提取溫度55℃、超聲提取時間20 min，在最佳條件下總黃酮提取率最高，提取率為1.01%.

兩種提取方法時間相當(dāng)，但采用超聲波－雙水相法提取總黃酮的提取率更高.超聲波－雙水相協(xié)同提取法操作簡單，提取與分離能同時完成，具有明顯的優(yōu)勢.

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

3 假酸漿總黃酮的純化

3.1 上柱溶液的制備

準(zhǔn)確稱取粉碎后的假酸漿子粉1 g，至于100 mL錐形瓶中，加入10 mL石油醚，超聲輔助提取20 min，去掉脂溶性成分.稱取4 g去掉油脂的假酸漿子粉末，按固液比1∶25加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液，提取溫度為50℃，預(yù)浸時間為10 min，控制微波輻射功率中火、微波輻射時間60 s、固液比1∶25、超聲提取溫度50℃、超聲提取時間20 min，得到總黃酮提取液，將提取液濃縮處理，得到樣品溶液.

3.2 大孔樹脂的預(yù)處理

樹脂用95%乙醇浸泡24 h充分溶脹后，濕法裝柱.再用95%乙醇淋洗至流出液不出現(xiàn)白色渾濁為止，依次用蒸餾水、5%HCl溶液、蒸餾水、5%NaOH溶液浸泡沖洗，最后用蒸餾水洗至中性，備用.

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的樹脂各2.0 g于三角瓶中，精密加入已知質(zhì)量濃度的樣品溶液30 mL，置于水浴震蕩器上在40℃條件下水浴震蕩6 h，靜置24 h充分吸附后，抽濾，得濾液和飽和吸附假酸漿總黃酮的樹脂，測定濾液中總黃酮含量計(jì)算樹脂飽和吸附量.取已飽和吸附的各種樹脂分別置于50 mL三角瓶中，精密加入70%乙醇35 mL，靜置24 h使樹脂充分解析，計(jì)算濾液中總黃酮的質(zhì)量濃度，并根據(jù)吸附量計(jì)算洗脫率.

表3 8種樹脂靜態(tài)飽和吸附量測定結(jié)果

根據(jù)表3數(shù)據(jù)分析得出，8種樹脂的洗脫率相差不大，但是HPD－500的飽和吸附量相對較高，在篩選的8種樹脂中，HPD－500樹脂吸附和解吸能力最好，故選擇HPD－500型樹脂作為分離純化假酸漿總黃酮的樹脂.3.3 動態(tài)吸附試驗(yàn)

根據(jù)吸附率和解吸率的比較，選擇比較理想的樹脂，考察上柱的時間、溫度、酸堿度、流速等因素對樹脂吸附性能的影響以及不同濃度的乙醇對洗脫率的影響.

3.3.1 時間對吸附量的影響

由圖1可知，飽和吸附量隨著時間的遞增而增加，在150 min時達(dá)到最大值，隨著時間繼續(xù)增加，飽和吸附量反而出現(xiàn)下降趨勢，因此選擇吸附時間為150 min.

圖1 時間對吸附量的影響

3.3.2 溫度對吸附量的影響

在圖2中可以看出，溫度對飽和吸附量的影響很明顯，在40℃時的吸附量達(dá)到峰值，因此選擇40℃較合適.

圖2 溫度對吸附量的影響

3.3.3 上樣液pH值對吸附量的影響

由圖3可知，在pH值為7時，吸附量達(dá)到最大，pH值繼續(xù)增大時，飽和吸附量迅速下降，因此保持上樣液pH值為7.

圖3 上樣液pH值對吸附量的影響

3.3.4 上樣液流速對吸附量的影響

從圖4可知，上樣液流速為0.5～1 mL/min時，隨著流速的增大，吸附量變化不大，而當(dāng)流速高于1 mL/min時，吸附量急劇下降，這可能是由于流速過快，被吸附物質(zhì)的分子尚未被樹脂吸附就以泄露［10］.0.5 mL/min 時的吸附量雖然比 1 mL/min稍高，但由于0.5 mL/min的速率較慢，耗時長，因此選擇1 mL/min的流速進(jìn)行吸附.

圖4 上樣液流速對吸附量的影響

3.3.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對洗脫率的影響

由圖5知，總黃酮的回收率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而迅速增大，到達(dá)70%時，洗脫率達(dá)到最大，因此選用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫.

4 結(jié)語

本文通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)得出超聲波輔助雙水相法的最佳提取條件為醇水比0.4，硫酸銨質(zhì)量濃度為0.25 g/mL，超聲時間為30 min，料液比為0.047.在最佳條件下得到總黃酮提取率最高，提取率為3.79%.超聲波微波法的最佳提取條件為微波輻射功率為中火、微波輻射時間為60 s、固液比為1∶25、超聲提取溫度為55℃、超聲提取時間為20 min，在最佳條件下得到總黃酮提取率為1.01%.HPD500型大孔樹脂吸附時間為150 min、溫度為40℃、上樣液 pH值為7、流速為1 mL/min、洗脫液為70%的乙醇時對假酸漿總黃酮有很好的純化效果.

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