吳茱萸堿的體外抗腫瘤活性研究

劉東梅，楊云云，杜俊潮，楊紅艷，郭 惠，王昌利，馬曉軍

（陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 咸陽712046）

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦辛、性溫?zé)?、有小毒，具有散寒止痛、降逆止吐、助陽止瀉之功效[1］。吳茱萸的主要活性成分為生物堿，其中吳茱萸堿（分子結(jié)構(gòu)見圖1）被認(rèn)為是吳茱萸生物堿的主要藥效成分之一，具有抗腫瘤、降壓、調(diào)節(jié)體溫、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎、抗過敏等作用[2－4］。關(guān)于吳茱萸堿的抗腫瘤活性，近年來國內(nèi)外已有一些報(bào)道[5－8］。MTT法是目前美國國立腫瘤研究所推行的抗癌藥物體外篩選法，用于測(cè)定活細(xì)胞及細(xì)胞增殖[9］。作者前期研究了吳茱萸堿的體內(nèi)抗腫瘤活性[7］，為了進(jìn)一步研究它的體外抗腫瘤活性，采用MTT法在不同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)了不同濃度的吳茱萸堿對(duì)S180、H22、HepG2腫瘤細(xì)胞的抑制情況。

圖1 吳茱萸堿的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structural formula of evodiamine

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株和培養(yǎng)基

小鼠S180腹水肉瘤細(xì)胞、小鼠H22腹水型肝癌細(xì)胞、人源HepG2肝癌細(xì)胞和人血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

完全培養(yǎng)基：RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司）85%，胎牛血清（Hyclone）10%，雙抗5%。

1.2 藥物及試劑

吳茱萸堿為合成所得[10］；四甲基偶氮唑鹽（MTT），Amresco公司；二甲基亞砜（分析純），鎮(zhèn)江市化學(xué)試劑廠；順鉑粉劑（cisplatin，DDP），規(guī)格：每支20 mg，山東齊魯制藥有限公司。

1.3 MTT比色法[11－12］

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備成濃度為2×105個(gè)·mL－1的細(xì)胞懸液。接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180 μL。24h后，每孔中加入20μL不同濃度（640μg·mL－1、320μg·mL－1、160μg·mL－1、80μg·mL－1、40μg·mL－1）吳茱萸堿溶液，使藥物的最終濃度為64 μg·mL－1、32μg·mL－1、16μg·mL－1、8μg·mL－1、4μg·mL－1。同時(shí)設(shè)空白組（不加藥物和細(xì)胞，其它與用藥組相同）、陽性對(duì)照組（順鉑DDP，終濃度4μg·mL－1）、對(duì)照組（加入細(xì)胞，不加藥物），每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔培養(yǎng)。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入20μL MTT，培養(yǎng)4h。貼壁細(xì)胞直接吸取出孔中上清液后加入150μL DMSO（懸浮細(xì)胞將細(xì)胞移至EP管中，離心棄上清，加入150μL DMSO），振蕩10min后用酶標(biāo)儀在492 nm處檢測(cè)OD值。所有實(shí)驗(yàn)在相同條件下重復(fù)3次，按下式計(jì)算細(xì)胞抑制率：

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以（珚x±s），采用Two－way ANOVA方差分析進(jìn)行兩組及多組樣本均數(shù)的比較，所得數(shù)據(jù)由graphpad prism5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 吳茱萸堿對(duì)S180肉瘤細(xì)胞的抑制率（表1 ）

表1 不同濃度的吳茱萸堿在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)S180肉瘤細(xì)胞的抑制率（珔x±s）Tab.1 The inhibition rate of evodiamine at different concentrations in 24h，48h，72hto S180cell lines

由表1 可知，吳茱萸堿在不同的作用時(shí)間對(duì)S180肉瘤細(xì)胞均呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，隨著濃度的增大，抑制率逐漸提高。在濃度為4μg·mL－1、8μg·mL－1時(shí)，吳茱萸堿對(duì)S180肉瘤細(xì)胞作用24h、48h、72h后，抑制率分別為14.18%、16.24%、19.37%和24.63%、24.77%、38.05%，其抑制率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)提高，說明在較低濃度下吳茱萸堿對(duì)S180肉瘤細(xì)胞的抑制率與時(shí)間呈正相關(guān)；當(dāng)濃度大于16μg·mL－1時(shí)，作用48h和72h，抑制率相差不大，說明在48h時(shí)已經(jīng)達(dá)到了穩(wěn)定抑制率，繼續(xù)延長(zhǎng)作用時(shí)間，抑制率沒有明顯提高。因此，吳茱萸堿對(duì)S180肉瘤細(xì)胞而言，屬于濃度依賴型藥物[12］。吳茱萸堿與對(duì)照組比較，作用極其顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與經(jīng)典的抗癌藥物順鉑比較，高濃度的吳茱萸堿對(duì)S180肉瘤細(xì)胞的抑制率比4μg·mL－1的順鉑高。

2.2 吳茱萸堿對(duì)H22肝癌細(xì)胞的抑制率（表2 ）

表2 不同濃度的吳茱萸堿在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)H22肝癌細(xì)胞的抑制率（珔x±s）Tab.2 The inhibition rate of evodiamine at different concentrations in 24h，48h，72hto H22cell lines

由表2 可知，吳茱萸堿在不同的作用時(shí)間對(duì)H22肝癌細(xì)胞均呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著濃度的增大，抑制率逐漸提高。但吳茱萸堿沒有時(shí)間相關(guān)性，各濃度在24h時(shí)即達(dá)到較為穩(wěn)定的抑制率，延長(zhǎng)作用時(shí)間，抑制率無明顯變化。吳茱萸堿與對(duì)照組比較，作用極其顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與經(jīng)典的抗癌藥物順鉑比較，在濃度為4μg·mL－1，作用24h、48h時(shí)，吳茱萸堿與4μg·mL－1的順鉑對(duì) H22肝癌細(xì)胞的抑制作用相當(dāng)；但作用72h時(shí)，4μg·mL－1的順鉑對(duì)H22肝癌細(xì)胞的抑制作用比同濃度的吳茱萸堿稍高，高濃度的吳茱萸堿對(duì)H22肝癌細(xì)胞的抑制率比4μg·mL－1的順鉑高。

2.3 吳茱萸堿對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的抑制率（表3 ）

由表3 可知，吳茱萸堿對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞既呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，又呈現(xiàn)時(shí)間依耐性。隨濃度增大和時(shí)間延長(zhǎng)，抑制率逐漸提高。吳茱萸堿與對(duì)照組比較，作用極其顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與經(jīng)典的抗癌藥物順鉑比較，濃度為4μg·mL－1的吳茱萸堿作用24h、48h時(shí)，對(duì) HepG2肝癌細(xì)胞的抑制作用比4μg·mL－1的順鉑稍差，但高濃度時(shí)，吳茱萸堿對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的抑制率比4μg·mL－1的順鉑高。作用72h時(shí)，濃度為32μg·mL－1、64μg·mL－1的吳茱萸堿對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的抑制率比4μg·mL－1的順鉑高，其它濃度的吳茱萸堿都比4μg·mL－1的順鉑的抑制率低。

表3 不同濃度的吳茱萸堿在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的抑制率（珔x±s）Tab.3 The inhibition rate of evodiamine at different concentrations in 24h，48h，72hto HepG2cell lines

2.4 吳茱萸堿對(duì)ECV304細(xì)胞的抑制作用

為了進(jìn)一步考察吳茱萸堿對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用，研究了不同濃度（64μg·mL－1、32μg·mL－1、16 μg·mL－1、8μg·mL－1、4μg·mL－1）的吳茱萸堿在24h對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304的抑制作用，結(jié)果見表4。

表4 24h下不同濃度吳茱萸堿對(duì)ECV304細(xì)胞的抑制作用Tab.4 The inhibition effects of evodiamine at different concentrations in 24hto ECV304cell lines

由表4可知，不同濃度的吳茱萸堿對(duì)ECV304細(xì)胞作用24h后，有一定的傷害作用，且濃度越高傷害越大，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50為124.65μg·mL－1。

2.5 吳茱萸堿的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50

通過回歸曲線可測(cè)得吳茱萸堿對(duì)S180、H22、HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度，結(jié)果見表5 。

表5 吳茱萸堿對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（IC50）Tab.5 The IC50values of evodiamine to 3types of tumor cell lines

由表5 可知，吳茱萸堿作用24h時(shí)，對(duì)H22肝癌細(xì)胞的抑制作用相對(duì)較好，IC50值最?。?7.49μg·mL－1）；作用48h時(shí)，對(duì)S180肉瘤細(xì)胞的抑制作用相對(duì)較好，IC50值最?。?7.54μg·mL－1）；作用72h時(shí)，對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的抑制作用相對(duì)較好，IC50值最?。?3.26μg·mL－1）。對(duì)同一種細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的IC50值進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿作用于S180肉瘤細(xì)胞72h時(shí)抑制作用最強(qiáng)；對(duì) H22肝癌細(xì)胞，24h時(shí)抑制作用最強(qiáng)；對(duì) HepG2肝癌細(xì)胞，72h時(shí)抑制作用最強(qiáng)。同時(shí)從IC50值也可以看出，吳茱萸堿對(duì)正常的人血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304也有一定的傷害作用；作用24 h后，IC50值為124.65μg·mL－1。提示吳茱萸堿有一定的細(xì)胞毒作用。

3 結(jié)論

采用MTT法在不同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)了不同濃度的吳茱萸堿對(duì)S180肉瘤細(xì)胞、H22肝癌細(xì)胞、人源HepG2肝癌細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果表明，吳茱萸堿在一定濃度下對(duì)三種腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用，且隨藥物濃度的增大，抑制率逐漸增大，與正常組比較作用極其顯著。吳茱萸堿作用24h時(shí)，對(duì)H22肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用較好，IC50值最?。?7.49μg·mL－1）；作用48h時(shí)，對(duì)S180肉瘤細(xì)胞的抑制作用相對(duì)較好，IC50值 最 小 （17.54μg·mL－1）；作 用 72h 時(shí)，對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的抑制作用最好，IC50值最小（13.26 μg·mL－1）。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和藥典（一部）[M］.2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：160.

[2]YU H，JIN H J，GONG W Z，et al.Pharmacological actions of multi－target－directed evodiamine[J］.Molecules，2013，18（2）：1826－1843.

[3]KO H C，WANG Y H，LIOU K T，et al.Anti－inflammatory effects and mechanisms of the ethanol extract of Evodia rutaecarpaand its bioactive components on neutrophils and microglial cells[J］.European Journal of Pharmacology，2007，555（2－3）：211－217.

[4]SHIN Y W，BAE E A，CAI X F，et al.In vitro and in vivo antiallergic effects on the fruits of Evodia rutaecarpaand its constituents[J］.Biological Pharmaceutical Bulletin，2007，30：197－199.

[5]YANG J，CAI X T，LU W G，et al.Evodiamine inhibits STAT3 signaling by inducing phosphatase shatterproof 1in hepatocellular carcinoma cells[J］.Cancer Letters，2013，328：243－251.

[6]SONG S C，CHEN Z Y，Li S X，et al.Design，synthesis and evaluation of N13－substituted evodiamine derivatives against human cancer cell lines[J］.Molecules，2013，18：15750－15768.

[7]WANG K L，HSIA S M，YEH J Y，et al.Anti－proliferative effects of evodiamine on human breast cancer cells[J］.Public Library of Science，2013，8（6）：e67297.

[8]CHRISTODOULOUA M S，SACCHETTI A，RONCHETTI V，et al.Quinazolinecarboline alkaloid evodiamine as scaffold for targeting topoisomerase I and sirtuins[J］.Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry，2013，21：6920－6928.

[9]FURUKAWA S.In vitro chemosensitivity of hepatocellular carcinoma for hepatic arterial infusion chemotherapy using the MTT assay with the combinations of antitumor drugs[J］.Kurume Med J，2004，51（1）：25－33.

[10]楊云云，郭惠，王昌利.吳茱萸堿的合成及其結(jié)構(gòu)表征和體內(nèi)抗腫瘤作用[J］.化學(xué)研究，2011，22（3）：22－25.

[11]WANG X，WANG H，ZHANG C，et al.Experimental study on inhibition of S180tumor cells by Agrimonia pilosa extract[J］.African Journal of Traditional，Complementary and Alternative Medicines，2013，10（3）：475－484.

[12]TIAN Q E，LI H D，YAN M，et al.Effects of astragalus polysaccharides on P－glycoprotein efflux pump function and protein expression in H22hepatoma cells in vitro[J］.BMC Complementary and Alternative Medicine，2012，12：94－104.

[13]朱林忠，朱旭，楊仁杰，等.不同化療藥物介入干預(yù)環(huán)境下對(duì)肝癌細(xì)胞系的敏感性[J］.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15（11）：1861－1865.