吡蚜酮在大鼠體內(nèi)的毒代動(dòng)力學(xué)研究

于 巍，林立紅，王 剛，孫常松，孟慶賀，李曉磊，段明郁

（1.沈陽化工研究院安全評(píng)價(jià)中心，遼寧 沈陽110021；2.沈陽科創(chuàng)化學(xué)品有限公司，遼寧 沈陽110144）

吡蚜酮化學(xué)名4，5－二氫－6－甲基－4－（3－吡啶亞甲基氨基）－1，2，4－3（2 H）－酮，屬非殺傷性新型殺蟲劑，具有高效、低毒、高選擇性、對(duì)環(huán)境生態(tài)安全等特點(diǎn)，主要通過食物鏈途徑進(jìn)入人體[1］。目前已報(bào)道的吡蚜酮檢測(cè)方法包括高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[2－3］、氣相色譜－質(zhì)譜法等[4－5］，多用來檢測(cè)煙草、煙堿、水果及蔬菜中的殘留量[6－7］，但用于檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)血漿藥物濃度尚未見報(bào)道。作者在此采用液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)不同染毒劑量下SD大鼠血漿中吡蚜酮的濃度，并研究其在大鼠體內(nèi)的毒代動(dòng)力學(xué)過程，擬為進(jìn)一步的深入研究提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器

SPF級(jí)SD雄性大鼠（質(zhì)量合格證號(hào)：211002300000434）11只，體重250～300g，遼寧長生生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)前禁食18h。

吡蚜酮原藥（純度98.0%），沈陽科創(chuàng)化學(xué)品有限公司；吡蚜酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.5%），沈陽化工研究院有限公司農(nóng)標(biāo)室；乙腈（色譜純），F(xiàn)isher公司；50%甲酸（色譜純），F(xiàn)luka公司；CO2（麻醉用）；玉米油（金龍魚牌非轉(zhuǎn)基因油）。

LC－20A／AB API3200 型 液 質(zhì) 聯(lián) 用 儀 （LC－MS／MS），配備 Analyst1.5.1軟件，島津公司；T18型勻漿機(jī)，IKA公司；Sartorius BP211D型電子天平（十萬分之一）；3K15型高速離心機(jī)，Sigma公司；移液器，Eppendorf公司。

DAS Ver2.0軟件，上海中醫(yī)藥大學(xué)藥物臨床研究中心編制。

1.2 方法

1.2.1 測(cè)試條件

色譜柱為 Phenomenex Luna C18（50mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為水－乙腈（含0.1%甲酸），梯度洗脫程序：水－乙腈（95∶5，體積比，下同），0.5min；水－乙腈（5∶95），2.0min；水－乙腈（95∶5），3.1min；水－乙腈（95∶5），5.0min；流速0.6mL·min－1；柱溫為室溫；進(jìn)樣量10μL；保留時(shí)間2.3min。

離子源為ESI源；離子源溫度500℃；噴霧電壓5 000V；CAD值3.00；EP值4.00V；CEP值15.91；GAS1值50.00；GAS2值55.00；氣簾氣值25.00；檢測(cè)方式為 MRM；定量離子對(duì)為218.30／105.30；DP值100.00V；CE值30.00；CXP值10.00。

1.2.2 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液：精確稱量吡蚜酮標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成1.00g·L－1的吡蚜酮母液，并稀釋成濃度（mg·L－1）為 1.00、2.00、4.00、8.00、20.0、80.0、160、200的梯度溶液。

質(zhì)控樣品工作溶液：用乙腈將1.00g·L－1的吡蚜酮母液稀釋成濃度（mg·L－1）為4.00、40.0、160的梯度溶液。

1.2.3 血漿樣品處理

向190μL空白大鼠血漿樣品（實(shí)驗(yàn)前從空白大鼠采集）中加入10μL吡蚜酮溶液，渦旋1min；取150 μL，加入300μL乙腈，渦旋混勻，置于離心機(jī)中以15 000r·min－1離心10min；取上清液100μL，加入900μL超純水稀釋后，進(jìn)樣分析。

取給藥大鼠血漿樣品30μL，加入60μL乙腈，渦旋混勻，置于離心機(jī)中以15 000r·min－1離心10 min；取上清液50μL，加入450μL超純水稀釋后，進(jìn)樣分析。

1.2.4 毒代動(dòng)力學(xué)研究

實(shí)驗(yàn)設(shè)高、低兩個(gè)劑量組，單次染毒。根據(jù)雄性大鼠急性經(jīng)口毒性LD50為5 820mg·kg－1，高劑量設(shè)定為限量劑量[8］，即1 000mg·kg－1；低劑量設(shè)定為雄性大鼠高劑量的1／10，即100mg·kg－1。

大鼠稱重，按100mg·kg－1和1 000mg·kg－1的劑量采取經(jīng)口灌胃方式，一次給足設(shè)計(jì)劑量，給藥后將大鼠放回代謝籠內(nèi)，自由進(jìn)食、飲水?？瞻讓?duì)照于給藥前采集血樣，高劑量組于投藥后的10min、30min、1h、2h、4h、7h、24h、31h、48h、72h、96h，低劑量組于投藥后的10min、30min、1h、2h、4h、5.5h、7h、12h、24h，經(jīng)眼眶靜脈叢采血0.1mL至肝素處理的離心管中，混勻，以8 000r·min－1離心10min，取上層血漿，置于－70℃冰箱冷凍保存，待測(cè)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

用DAS Ver2.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，計(jì)算毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括達(dá)峰時(shí)間（tmax）、峰值濃度（cmax）、消除半衰期（t1／2β）、表觀分布容積（Vz）、體內(nèi)總清除率（CLz）、毒時(shí)曲線下面積[AUC（0～t）、AUC（0～∞）］，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用梯形法計(jì)算AUC、cmax與tmax均為實(shí)測(cè)值。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析方法的方法學(xué)考察

2.1.1 特異性

分別將空白大鼠血漿樣品、空白大鼠血漿加入吡蚜酮標(biāo)準(zhǔn)品、給藥1 000mg·kg－11.0h后的大鼠血漿樣品按1.2.3方法前處理，進(jìn)行LC－MS／MS分析，結(jié)果見圖1。

a.空白大鼠血漿 b.空白大鼠血漿添加吡蚜酮標(biāo)準(zhǔn)品c.給藥1 000mg·kg－11.0h后的大鼠血漿樣品

圖1 不同樣品的LC－MS／MS圖譜

Fig.1 LC－MS／MS Chromatograms of different samples

由圖1可見，血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)吡蚜酮的分析沒有影響，方法的特異性良好。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

用空白大鼠血漿稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，配制成濃度（mg·L－1）分別為0.050、0.100、0.200、0.400、1.00、4.00、8.00、10.0的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。按1.2.3方法前處理，進(jìn)行LC－MS／MS分析。以吡蚜酮的峰面積（Y）對(duì)濃度（X）繪制曲線，擬合得回歸方程為Y＝aX2＋bX＋c，結(jié)果見表1 。

由表1 可知，吡蚜酮在0.050～10.0mg·L－1范圍內(nèi)相關(guān)性良好。

表1 吡蚜酮大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程參數(shù)Tab.1 Parameters of regression equation of pymetrozine in rat plasma

2.1.3 準(zhǔn)確度和精密度

用空白大鼠血漿稀釋質(zhì)控樣品工作溶液，配制成考察準(zhǔn)確度與精密度的質(zhì)控樣品（QC），吡蚜酮濃度（mg·L－1）分別為0.200、2.00和8.00，按1.2.3方法前處理，進(jìn)行LC－MS／MS分析，每天配制一套標(biāo)準(zhǔn)曲線和QC樣品，平行進(jìn)行3d，考察方法的準(zhǔn)確度、批內(nèi)精密度與批間精密度，結(jié)果見表2 。

表2 吡蚜酮在大鼠血漿中的準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性／%Tab.2 Recovery，precision and stability of pymetrozine in rat plasma／%

由表2 可知，準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果符合方法學(xué)要求。

2.1.4 穩(wěn)定性

用空白大鼠血漿稀釋質(zhì)控樣品工作溶液，配制成吡蚜酮濃度（mg·L－1）分別為0.200、2.00和8.00的質(zhì)控樣品，各12份，其中6份室溫放置0h、4h、6h后按1.2.3方法前處理，進(jìn)行LC－MS／MS分析，考察其室溫穩(wěn)定性；另外6份分別在－70℃冰箱保存1周、2周和4周后按1.2.3方法前處理，進(jìn)行LC－MS／MS分析，考察其－70℃冰箱保存穩(wěn)定性；另外配制3種濃度的吡蚜酮血漿樣品保存于－70℃冰箱中，于24h、48h和72h取出反復(fù)凍融，按1.2.3方法前處理，進(jìn)行LC－MS／MS分析，考察其凍融穩(wěn)定性，結(jié)果見表2 。

由表2 可知，各條件下吡蚜酮樣品均穩(wěn)定。

2.2 吡蚜酮在大鼠體內(nèi)的毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

大鼠經(jīng)口灌胃給予吡蚜酮后，血漿藥物濃度－時(shí)間曲線如圖2所示，經(jīng)DAS Ver2.0軟件處理，采用統(tǒng)計(jì)矩模型計(jì)算，結(jié)果見表3 。

圖2 吡蚜酮大鼠血漿藥物濃度－時(shí)間曲線Fig.2 Concentration－time curves of pymetrozine in rat plasma

由圖2可知，SD大鼠經(jīng)口灌胃給予吡蚜酮后，血漿中10min即可檢出毒物，給藥后低、高劑量組分別在4h和2h藥物濃度達(dá)峰，而后隨時(shí)間延長逐漸下降，分別在24h、48h時(shí)血漿藥物濃度均低于cmax的5%。

表3 吡蚜酮主要毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（n＝5）Tab.3 Toxicokinetics parameters of pymetrozine（n＝5）

由表3 可知，低、高兩個(gè)劑量組：達(dá)峰時(shí)間（tmax）分別為4h和2h；峰值濃度（cmax）分別為36 180μg·L－1和69 388μg·L－1；消除半衰期（t1／2β）分別為18.972h和33.177h，高劑量較長，提示其消除較慢，可能在體內(nèi)蓄積，且1 000mg·kg－1劑量組已基本達(dá)吸收飽和；表觀分布容積（Vz）較小，分別為2.65L·kg－1和8.236L·kg－1，說明吡蚜酮對(duì)血漿外組織親和力較弱；體內(nèi)總清除率（CLz）分別為0.107L·h－1·kg－1和0.266L·h－1·kg－1；毒 時(shí) 曲 線 下 面 積 [AUC（0～t）］分 別 為652 604.71μg·h· L－1和1 674 767.1μg·h· L－1；AUC（0～∞）分 別 為 931 164.77 μg· h· L－1和1 876 484.6μg·h· L－1。

2.3 討論

吡蚜酮為低毒農(nóng)藥，臨床未見有急性中毒的報(bào)道。本研究表明，吡蚜酮能迅速吸收進(jìn)入血液，隨后快速分布，緩慢消除。經(jīng)DAS Ver2.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用統(tǒng)計(jì)矩模型計(jì)算，得到低、高劑量組的 AUC（0～t）的比值為0.39、AUC（0～∞）的比值為0.50，提示其與給藥劑量不成比例（給藥劑量比為0.10），呈現(xiàn)出非線性代謝動(dòng)力學(xué)特征。

3 結(jié)論

采用LC－MS／MS分析方法研究不同染毒劑量下吡蚜酮在SD大鼠體內(nèi)的毒代動(dòng)力學(xué)特征。色譜柱為Phenomenex Luna C18（50mm×4.6mm，5μm），采用ESI離子源，定量離子對(duì)為218.30／105.30。結(jié)果表明，大鼠經(jīng)口灌胃給予吡蚜酮后，由統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)表示的低、高兩個(gè)劑量組主要毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下：達(dá)峰時(shí)間（tmax）分別為4h和2h；峰值濃度（cmax）分別為36 180 μg·L－1和69 388μg·L－1；消除半衰期（t1／2β）分別為18.972h和33.177h；表觀分布容積（Vz）分別為2.65 L·kg－1和8.236L·kg－1；體內(nèi)總清除率（CLz）分別為：0.107L·h－1·kg－1和0.266L·h－1·kg－1；毒時(shí)曲線下面積[AUC（0～t）］分別為652 604.71μg·h·L－1和1 674 767.1μg·h· L－1；AUC（0～∞）分別為931 164.77μg·h· L－1和1 876 484.6μg·h·L－1。在毒性劑量下，吡蚜酮在大鼠體內(nèi)的毒代動(dòng)力學(xué)過程具有非線性動(dòng)力學(xué)特征。值得注意的是，1 000 mg·kg－1劑量組消除半衰期較長，易發(fā)生蓄積。

采用LC－MS／MS進(jìn)行檢測(cè)，方法準(zhǔn)確、靈敏，可為吡蚜酮毒代動(dòng)力學(xué)的深入研究提供方法學(xué)依據(jù)，進(jìn)而為毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)。

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