黃褐毛忍冬生藥學(xué)鑒定研究

蔣向輝　肖龍騫　楊永平

摘要：? 黃褐毛忍冬具有消炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等多種功效，但容易與忍冬屬其他物種混淆，通過生藥學(xué)研究將為黃褐毛忍冬的鑒定工作和藥材標準的制定提供科學(xué)依據(jù)。該文采用植物學(xué)鑒定、顯微鏡觀察、薄層色譜鑒定和分子鑒定的方法從植物學(xué)性狀、藥材顯微特征、薄層色譜和ITS（internal transcribed spacer）序列特征等方面對黃褐毛忍冬進行了專屬性特征鑒定。結(jié)果表明：（1）黃褐毛忍冬花朵橫切面分泌細胞較多，花瓣外表面有黃褐色腺毛;花冠表皮上層細胞為多角形，蚌形花粉囊對開，花粉粒形狀規(guī)則，有三角形和卵圓形兩種，油室橢圓形。（2）粉末顯微檢測發(fā)現(xiàn)中柱鞘纖維呈短棱形;木栓細胞棱角明顯，呈淺黃色;木纖維呈粗短的棱形，偶見有彎曲;網(wǎng)紋導(dǎo)管較多，細胞腔密布草酸鈣方晶。（3）薄層色譜顯示黃褐毛忍冬花中三柰酚含量較高，三柰酚可作為黃褐毛忍冬的檢視成分。（4）基于ITS序列系統(tǒng)聚類結(jié)果顯示，ITS序列可以作為DNA條形碼將黃褐毛忍冬、灰氈毛忍冬、華南忍冬和金銀花準確地區(qū)分。上述結(jié)果表明黃褐毛忍冬生藥學(xué)特征明顯，該研究為黃褐毛忍冬藥材鑒定、成分分析和質(zhì)量標準制定提供了參考。

關(guān)鍵詞： 黃褐毛忍冬， 顯微特征， 薄層色譜（TLC）鑒定， ITS序列聚類分析， 生藥學(xué)研究

中圖分類號：? Q946; R282.71文獻標識碼：? A文章編號：? 1000-3142（2022）05-0738-07

Pharmacognostic identification study

of Lonicera fulvotomentosa

JIANG Xianghui XIAO Longqian YANG Yongping

Abstract：? Lonicera fulvotomentosa has many functions including antiinflammatory， antibacterial， immune regulation， etc.， but it is easily confused with other species of Lonicera. The pharmacognostic research of L. fulvotomentosa will provide a scientific basis for its identification and the formulation of medicinal materials standards. This study combined botanical identification， microscopic observation， thin layer chromatography （TLC） identification， and molecular identification to identify specific characteristics of L. fulvotomentosa， from the aspects of botanical traits， microscopic characteristics of medicinal materials， TLC and ITS sequence feature. The results are as follows： （1） There are many secretory cells on the crosssection of the flower， many yellowbrown glandular hairs are on the surface of the bract has， the upper layer cell of corolla epidermis is polygonal， the pollen sac is musselshaped， the pollen grains are triangular or oval， and the oil chamber is? oval. （2）The results of powder microscopy show that the middle column sheath fibers are short prisms; The cork cells are sharply angular and light yellow; The wood fibers are stubby and prismatic， a few of which are bent; There are many reticulated catheters， and the calcium oxalate square crystals are densely packed in the cell cavity. （3） TLC shows that the content of kaempferol in the flower of L. fulvotomentosa is higher， and kaempferol can be used as the identification component of L. fulvotomentosa. （4） The cluster analysis results based on ITS sequences show that the ITS sequence can be used as the DNA barcode to distinguish L. fulvotomentosa， L. macranthoides， L. confusa and L. japonica. This study provides a theoretical reference for the identification， component analysis， and quality standard formulation of L. fulvotomentosa.032BA245-D028-4DA2-A536-F4FF14202739

Key words： Lonicera fulvotomentosa， microscopic features， thin layer chromatography （TLC） identification， ITS sequence cluster analysis， pharmacognostic study

黃褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa）為忍冬科忍冬屬藤本植物，主要分布在我國云南、貴州和廣西等?。▍^(qū)）（國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會， 1998），其營養(yǎng)成分及化學(xué)組成與忍冬（L. japonica）相似（Wu et al.， 2015），黃褐毛忍冬常被作為忍冬的替代品使用，在預(yù)防和治療流感、SARS、冠狀病毒等方面有較好的療效（He et al.， 2017; Wang et al.， 2019）。已有研究表明，忍冬屬藥用植物初開的花或花蕾中含有酚酸、類黃酮、三萜皂苷和生物堿等多種活性成分（Shang et al.， 2011），忍冬中咖啡?？崴嵫苌镉锌鼓[瘤活性和抗艾滋病病毒（HIV）活性（Mishima et al.， 2005），Han等（2014）研究也認為忍冬屬藥用植物活性成分在人類疑難雜癥與流行性疾病的治療和預(yù)防中有極好的開發(fā)利用前景。

黃褐毛忍冬和金銀花（L. japonica）雖然同為忍冬屬藥用植物，但因其化學(xué)成分差異明顯，故我國2015版藥典對黃褐毛忍冬和金銀花主要成分含量的標準并不相同（中華人民共和國國家藥典委員會， 2015）。我國中醫(yī)習(xí)慣將黃褐毛忍冬當作金銀花的替代品使用，為了避免黃褐毛忍冬和金銀花混用產(chǎn)生不良后果，有必要建立準確的鑒定與分析方法。雖然已有學(xué)者從形態(tài)學(xué)鑒定、顯微鑒定、光譜鑒定、理化鑒定和生物技術(shù)鑒定等方面進行過灰氈毛忍冬與金銀花的比較研究（Zhang et al.， 2019），但由于忍冬屬植物的花蕾中都含有豐富的酚酸、類黃酮、三萜類皂苷等化合物（Shang et al.， 2011），營養(yǎng)成分與化學(xué)組成都極為相似，僅從成分方面將黃褐毛忍冬與金銀花分開難度較大。目前，關(guān)于黃褐毛忍冬的生藥鑒定有過一些報道，但不夠詳盡，不方便實際鑒定工作。為了更好地對黃褐毛忍冬進行質(zhì)量控制，確保其藥效以及臨床應(yīng)用，有必要對黃褐毛忍冬進行全面的生藥學(xué)特征鑒別研究，建立多種方法與技術(shù)聯(lián)合的鑒定分析技術(shù)，為黃褐毛忍冬藥材鑒定、成分分析和質(zhì)量標準制定提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料、儀器和試劑

樣品來自貴州省興義則戎鎮(zhèn)，經(jīng)湖南省林業(yè)科學(xué)研究院王旭軍研究員鑒定為忍冬科忍冬屬植物黃褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa）的花及花蕾。標本存放于懷化學(xué)院生物與食品工程學(xué)院標本室。

儀器：COSUAI型粉碎機（湖南基德電器公司）;科隆101型恒溫干燥箱（懷化科儀公司）;BSM型電子天平（上海精平儀器公司）;HH1型恒溫水浴鍋（長沙科儀公司）;VILBER INFINITY 3026凝膠成像儀（上海制承儀器公司）;YH/TDL5000bR冷凍離心機（四川致研科技有限公司）;1010電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海姚氏儀器設(shè)備廠）;API258輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機（杭州艾普設(shè)備有限公司）;XSP201B生物顯微鏡（上海譜騫光學(xué)儀器有限公司）;3PrimeX基因擴增儀（英國Techne公司）。試劑：碘、碘化鉀、番紅、甲醛、醋酸、蘇木精染液、石蠟、甘油、PCR試劑（TAQ酶、dNTP）、TBE緩沖液。

1.2 方法

1.2.1 性狀鑒別觀察黃褐毛忍冬的莖、葉和花形態(tài)特征及新鮮藥材的顏色、形狀、大小、質(zhì)地、斷裂等特征。

1.2.2 顯微鑒別參照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0502）試驗方法，采集新鮮黃褐毛忍冬的花及花蕾放于安瓿瓶，加入適量的蘇木精染液，放于40 ℃溫箱中24～36 h，沖凈后用稀氨水（1%～2%）浸泡15 min，洗凈后依次用35%、55%、75%和95%酒精脫水，在二甲苯浸泡4～6 min后石蠟包埋過夜。用刀片將包埋好的樣品進行修塊，用酒精燈將其粘貼在小木塊上，切片，明膠固定，吸水紙吸去一側(cè)水，放于烘片機上烤干，待其干后，用生物顯微鏡觀察，放于40 ℃恒溫箱中烘烤10 d以上，脫蠟，95%酒精配制的番紅染液復(fù)染，洗脫后封片再觀察。

1.2.3 薄層色譜鑒別參照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0502）試驗方法，分別將黃褐毛忍冬花、幼葉和幼莖粉碎，過40目篩，各稱取粉末1.0 g，分別加入20 mL 50%乙醇溶液，水浴回流加熱30 min后，置冰水中冷卻，抽濾后取濾液，濾液于蒸發(fā)皿上揮發(fā)至干燥，向殘留物中加入4 mL甲醇，將殘留物溶于甲醇備用。另以甲醇作為溶劑，制備0.50 mg·mL1的山柰酚對照品溶液。將上述溶液點于同一硅膠G薄層板，采用酸乙酯∶甲酸∶水（8∶1∶1）作為展開劑，于25 ℃和65%溫濕度條件下展開，噴10%的硫酸乙醇，干燥后置365 nm的紫外燈下檢視。

1.2.4 分子鑒別參照蔣向輝等（2010）采用改良CTAB法分別提取黃褐毛忍冬幼葉、老葉和花的總DNA提取并設(shè)計引物，引物序列ITS～F：GGAAGGTAAAAGTCAAGG;ITS～R：TCCTCCGCTT

ATTGATATGC。參照蔣向輝等（2010）的PCR擴增程序進行PCR擴增，DNA片段回收并克隆到pMD 18T載體，挑選6個陽性克隆提取質(zhì)粒測序，同時對PCR產(chǎn)物直接測序。從NCBI（National Center for Biotechnology Information ）數(shù)據(jù)庫下載包含完整的ITS1（internal transcribed spacer 1）和ITS2（internal transcribed spacer 2）的忍冬屬物種ITS序列，采用MEGA X軟件對測得序列與NCBI上登錄的忍冬屬物種ITS序列采用非加權(quán)組平均法（unweighted pairgroup method with arithmetic means， UPGMA）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。032BA245-D028-4DA2-A536-F4FF14202739

2結(jié)果與分析

2.1 性狀鑒別

黃褐毛忍冬為多年生攀援植物，莖和分枝上有黃褐色柔毛，幼枝上偶見有橘紅色腺毛，幼芽鱗片通常為4 對。不同生長時期葉形由針葉到橢圓變化，葉色由黃褐色逐漸變?yōu)榫G色。成熟葉長為4.0～7.0 cm，寬為1.5～3.0 cm，葉柄長為4.0～7.0 cm，葉柄密布黃褐色腺毛，較硬，葉片為狹長橢圓形，葉片上下表面均被黃褐色腺毛，葉脈網(wǎng)狀分布，中脈處腺毛明顯可見。莖頂端葉間距1.0～1.5 cm，下部間距較寬，可達6.0 cm。短總狀花序著生于葉腋或幼枝頂部。小苞片為長鉆形，長為4.0～7.0 mm，小苞片上密布硬而短的腺毛。卵狀橢圓形萼筒長1.0～3.0 mm，萼筒上無毛，萼齒較萼筒長?；ǘ淝捌诎咨?，后期變?yōu)辄S色。開放的花朵長3.0～5.0 cm，花筒較唇瓣短，外被黃褐色短腺毛，花絲和花柱較長，雄蕊和柱頭外露，表面光滑無毛，柱頭為短橢圓形。節(jié)間較短，節(jié)間花束常為10～22 束，開花較整齊?；ㄆ谳^短，僅2周左右。漿果球狀黑色。

2.2 花橫切面顯微鑒別

黃褐毛忍冬花冠表皮細胞垂周壁鏈珠狀增厚，外平周壁可見波浪狀條紋?；ǚ勰绎枬M，呈長蚌狀，左右對開，直徑310.0～370.0 μm?；ò瓯砥ぜ毎M長，排列緊密，細胞壁呈長條狀增厚。垂周壁中有多數(shù)草酸鈣簇晶，棱角較為尖銳?；ò瓯”诩毎鼒A形，直徑4.0～12.0 μm?；ǚ哿ＮⅫS色，呈長三角形或長卵圓形，直徑為5.0～15.0 μm。花粉?？梢娪休^明顯的萌發(fā)孔溝。油室呈短橢圓形，切面分泌細胞較多，附近可見有黃棕色分泌物和單細胞非腺毛。具體見圖1。

2.3 花粉末顯微特征

花粉粉碎后呈黃色，單細胞球形，偶見有淡黃綠色（圖2）。中柱鞘纖維呈短棱形，細胞直徑19.0～47.0 μm，細胞壁較薄，厚度僅為2.0～7.0 μm。木栓細胞棱角明顯，呈淺黃色，數(shù)目較多。木纖維呈粗短的棱形，偶見有彎曲，成束或散在分布，細胞直徑5.0～52.0 μm，細胞壁厚2.0～14.0 μm，細胞壁紋孔明顯，呈斜裂狀。木化薄壁細胞淀粉粒復(fù)粒較多。具緣紋孔及網(wǎng)紋導(dǎo)管較多，直徑約25.0～50.0 μm。含晶細胞壁木質(zhì)化增厚較為明顯，細胞腔內(nèi)草酸鈣方晶較多。樹脂道散布有黃棕色分泌物，半透明狀。

2.4 薄層色譜鑒別

將黃褐毛忍冬、華南忍冬、金銀花和灰氈毛忍冬的花提取物與三柰酚點于同一薄層G板上，置365 nm紫外燈下檢視。由圖3 可知， 三柰酚與忍a. 子房縱切面; b. 花冠內(nèi)表皮; c. 花冠外表皮; d. 花絲細胞中簇晶; e. 花粉粒; f. 油室。

冬屬四個物種的花提取物在相同位置都發(fā)出強的淺藍色熒光，其中金銀花與灰氈毛忍冬能檢視到四條譜帶，華南忍冬可檢視到三條譜帶，而黃褐毛忍冬僅能檢視到兩條譜帶，且黃褐毛忍冬在三柰酚處的譜帶比其他三個物種更為清晰。結(jié)果表明，黃褐毛忍冬花中三柰酚含量較高，通過檢視三柰酚薄層色譜譜帶特征，可以將黃褐毛忍冬與華南忍冬、金銀花和灰氈毛忍冬區(qū)分開。

2.5 分子鑒別

由圖4可知，分別以黃褐毛忍冬幼葉、老葉和花的基因組DNA為模板可得到同樣大小的條帶（圖4），長度為615 bp。將測序獲得的ITS序列拼接校驗后，放入NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對確認，從NCBI下載包含完整ITS1和ITS2，且長度在600～620 bp之間的忍冬屬17份種質(zhì)ITS序列，采用UPGMA法將黃褐毛忍冬與忍冬屬其他17份種質(zhì)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖5可知，17個物種大致分為兩大組：山銀花（灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬、華南忍冬）和金銀花可以聚為一組，這一組為忍冬屬藥用物種;另一組為忍冬屬其他物種，兩組的自展支持率均為100%，表明以ITS序列為參考將17個物種劃分兩組的可信度較高。從圖5還可以看出，黃褐毛忍冬與灰氈毛忍冬、華南忍冬親緣關(guān)系較近，本研究為這3個物種同屬于山銀花這一大類提供了依據(jù)。同時結(jié)果表明，ITS序列可以作為DNA條形碼將黃褐毛忍冬與灰氈毛忍冬、華南忍冬和金銀花區(qū)分開。

3討論與結(jié)論

近年來，我國中醫(yī)在中藥材的使用過程中對特定的藥用物種或品種及其化學(xué)成分的選擇性并未給予太多重視，中藥材被當作一種天然化學(xué)混合物使用，通常粗略地認為同屬的幾個藥用物種可以相互替代。然而，具有不同化學(xué)成分的同屬藥材可能表現(xiàn)出不同的藥理作用，并且不同成分之間可能發(fā)生協(xié)同或拮抗作用（Sajeli et al.， 2015），容易導(dǎo)致中藥在療效上產(chǎn)生較大的差異。鑒定中藥材的植物來源是我國中藥使用中急需關(guān)注的問題。中藥材活性成分較多且影響其含量變化的因素復(fù)雜，這是影響中藥材質(zhì)量鑒定和評價的一大瓶頸，必須建立針對不同藥材具有獨特性和專一性的檢測分析技術(shù)和質(zhì)量標準。近年來，不斷完善的薄層色譜技術(shù)已經(jīng)成為天然產(chǎn)物化學(xué)成分鑒定與分析中一種相對便宜且易于使用的工具（gnes et al.， 2018），特別是近年來發(fā)展起來的高效薄層層析法（HPTLC）簡單快捷，能同時檢測多個成分，該技術(shù)對于槲皮素和山柰酚等黃酮類成分的檢測極為靈敏（Hiteksha et al.， 2017）。薄層色譜技術(shù)在藥材檢測中推廣和應(yīng)用的前提是首先必須要找到每種藥材獨特和專一性的指標成分，對藥材進行生藥學(xué)研究是獲得藥材獨特性和專一性成分的基本途徑。

忍冬屬藥用植物在治療外源性風(fēng)熱、流行性發(fā)熱疾病、瘡疥等傳染病方面有特效（Han et al.， 2014），其抗菌、抗炎、抗氧化等成分與其獨特的藥理活性緊密相關(guān)（Yu et al.， 2019）。忍冬屬植物是一個藥用物種較多的種屬，包括2亞屬4組14亞組200種。中國藥典中收載的忍冬屬五種植物在花蕾形態(tài)上相似，極容易混淆，由于化學(xué)成分不盡相同，因此臨床用法用量也是各有特色（Chu et al.， 2011）。自2015版藥典出版以來，山銀花（灰氈毛忍冬、華南忍冬、黃褐毛忍冬和紅腺忍冬）被視為是金銀花（忍冬）常見摻假品，而在實踐中，由于我國中醫(yī)或民族民間醫(yī)生使用習(xí)慣與方法的差異，所以不同醫(yī)生在治療不同疾病的過程中使用的品種各不相同。采用多種技術(shù)聯(lián)用對忍冬屬藥用植物進行全面生藥學(xué)鑒定對于提高相關(guān)藥材的療效有重要的指導(dǎo)作用。本研究結(jié)合常規(guī)植物學(xué)性狀鑒別、顯微觀察、薄層色譜鑒定和分子鑒別從微觀到宏觀對黃褐毛忍冬進行了全面的生藥學(xué)鑒定。楊培等（2007）通過粉末顯微檢測，找到了黃褐毛忍冬花蕾薄壁和厚壁兩種不同類型的非腺毛，本研究在此基礎(chǔ)上檢測到黃褐毛忍冬粉末中帶有黃棕色分泌物的分泌細胞，這些分泌細胞可能與黃褐毛忍冬藥材顏色有關(guān);通過薄層色譜檢測發(fā)現(xiàn)黔產(chǎn)灰氈毛忍冬和黃褐毛忍冬與綠原酸對照品在相同的位置上雖然有相同顏色的熒光斑點，但斑點數(shù)目與大小基本一致，不適合用于忍冬屬不同物種的鑒別。本研究結(jié)果表明三柰酚在黃褐毛忍冬中譜帶清晰，含量較高，而在華南忍冬、金銀花和灰氈毛忍冬中除三柰酚外還發(fā)現(xiàn)有兩個以上其他斑點，具體成分有待鑒定。因此認為，三柰酚可以作為黃褐毛忍冬薄層色譜檢測的一個重要的指標，該化合物為有別于金銀花特征性成分綠原酸與木犀草素的黃酮類化合物。032BA245-D028-4DA2-A536-F4FF14202739

隨著后基因組時代的來臨，忍冬屬藥用物種基因組學(xué)大數(shù)據(jù)的獲得更容易實現(xiàn)，基于分子系統(tǒng)學(xué)和基因組學(xué)研究有望為揭示黃褐毛忍冬這一道地藥材的品質(zhì)形成機制提供可能。DNA條形碼能真實反映物種進化關(guān)系，在物種鑒別中有很大的推廣應(yīng)用前景（Gao et al.， 2017）。我國傳統(tǒng)中藥是藥材提取物或是干燥的原藥材，DNA提取較為困難，且PCR產(chǎn)物較短，擴增產(chǎn)物序列越短越容易擴增（Sarkinen et al.， 2012）。核糖體DNA的ITS2序列長度通常為260 bp左右，研究表明這是一個較好的DNA條碼區(qū)域，其具有較高的種間差異和種內(nèi)保守性（Han et al.， 2013）。Han等（2013）使用ITS2從忍冬屬植物中鑒定金銀花，但其擴展得到的ITS2比預(yù)期要短，并且我國中藥大多是復(fù)方，涉及多種藥材，僅憑一對ITS2通用引物對于數(shù)十種草藥的鑒別效果并不理想，這對商業(yè)用途構(gòu)成了很大的障礙。本研究以新鮮的黃褐毛忍冬葉和花為材料獲得了ITS序列，其長度為615 bp，從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得的ITS序列長度，金銀花為617 bp，華南忍冬為613 bp，灰氈毛忍冬為613或610 bp。聚類分析結(jié)果顯示，在忍冬屬藥用物種中，黃褐毛忍冬與灰氈毛忍冬、華南忍冬親緣可歸為一大類，而金銀花歸為另一類。本研究結(jié)果表明基于ITS序列研究忍冬屬藥用植物的遺傳和進化機制有助于忍冬屬植物的分類與鑒別，ITS序列可以作為DNA條形碼將黃褐毛忍冬、灰氈毛忍冬、華南忍冬和金銀花忍冬屬四個物種進行區(qū)分。

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（責任編輯周翠鳴）

收稿日期：? 2021-01-08

基金項目：? 湖南省教育廳重點資助項目（19A390）;湖南省教育廳創(chuàng)新平臺項目（16K069）;貴州省科技廳社會發(fā)展項目（黔科合支撐 [2018]2823） [Supported by Key Project Fund of Hunan Provincial Department of Education （19A390）; Innovation Platform Project of Hunan Provincial Department of Education （16K069）; Social Development Project of Guizhou Provincial Department of Science and Technology （Qiankehe Support? [2018]2823）]。

第一作者： 蔣向輝（1974-），博士，副教授，主要從事藥用植物鑒定與成分分析研究，jxfei789@163.com。032BA245-D028-4DA2-A536-F4FF14202739