過(guò)表達(dá)大豆類受體蛋白激酶基因RLPK2促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片的衰老

張強(qiáng)　黃卓然　胡康龍　許超　楊青青　薛濤

摘要：大豆RLPK2基因（GenBank登錄號(hào)：AY687391）是一個(gè)編碼N末端富含亮氨酸重復(fù)序列的類受體蛋白激酶基因。為分析大豆RLPK2基因的功能，該研究以野生型擬南芥和大豆RLPK2基因過(guò)表達(dá)擬南芥植株為材料，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，構(gòu)建了大豆RLPK2基因過(guò)表達(dá)載體，分析了葉片衰老過(guò)程中葉綠素?zé)晒鈪?shù)、抗氧化酶活性及衰老相關(guān)基因表達(dá)量的變化。結(jié)果表明：（1）無(wú)論是野生型還是轉(zhuǎn)基因擬南芥，隨著葉片衰老進(jìn)程的進(jìn)行，光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率（ΦPSⅡ）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）和光合電子傳遞速率（ETR）均呈下降趨勢(shì)，但后者下降趨勢(shì)更明顯;（2）激發(fā)壓（1qP）在葉片衰老前期的變化較為平穩(wěn)，后期則急劇增加，且轉(zhuǎn)基因型比野生型擬南芥增加更明顯;（3）在葉片衰老的各個(gè)時(shí)期，轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片丙二醛（MDA）含量均顯著高于野生型，而超氧化物岐化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性均顯著低于野生型;（4）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，RLPK2轉(zhuǎn)基因擬南芥中衰老標(biāo)志基因ATSAG12，衰老關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ATNAP、ATWRKY6和葉綠素降解關(guān)鍵酶編碼基因ATACD1表達(dá)量顯著上調(diào)。綜上認(rèn)為，大豆類受體蛋白激酶基因RLPK2參與調(diào)控植物葉片衰老進(jìn)程，其表達(dá)對(duì)葉片衰老具有促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：大豆RLPK2基因，葉片衰老，激發(fā)壓，抗氧化酶，丙二醛

中圖分類號(hào)：Q943;S565.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：10003142（2022）05072909

Overexpressionnofsoybeanreceptorlikeproteinkinase

RLPK2genefromGlycinemaxpromotestransgenic

Arabidopsisthalianaleafsenescence

ZHANGQiang，HUANGZhuoran，HUKanglong，XUChao，YANGQingqing，XUETao*

Abstract：SoybeanRLPK2gene（GenBankaccessionNo.AY687391）isareceptorlikeproteinkinasegenethatencodesaleucinerichrepeat（LRR）receptorkinasetypeproteinencodedwithaNterminal.InordertofurtheranalyzethefunctionofthesoybeanRLPK2gene，theoverexpressionvectoroftheRLPK2genewasconstructedviaagrobacteriummediatedtransformationofArabidopsisthaliana.Inthisstudy，wildtype（WT）andtransgenicA.thalianaplantswereusedasmaterials，andthevariationsinchlorophyllfluorescenceparametersandtheactivitiesofantioxidantenzymesaswellastheexpressionlevelsofsenescenceassociatedgenesintheagingprocessofleaveswereinvestigated.Theresultswereasfollows：（1）BothWTandtransgenicplantstendedtodecreasetheefficiencyofprimaryconversionoflightenergyofphotosystemⅡ（PSⅡ）（Fv/Fm），actualphotochemicalefficiencyofPSⅡ（ΦPSⅡ），photochemicalquenchingcoefficient（qP）andelectrontransportrate（ETR）whilethelattershowedamoreobviousdecreasingpatternasagingprogressed.（2）ThePSⅡexcitationpressure（estimatedas1qP）wasrelativelystableintheearlystageofleafsenescence，andincreasedsharplyinthelaterstageofleafsenescence，whilethetransgenicplantsshowedamoreobviousincreasingtrend.（3）Atdifferentleafsenescencestages，themalondialdehyde（MDA）contentwassignificantlyhigherintransgenicplantsthanthatinWT，whiletheactivitiesofsuperoxidedismutase（SOD），peroxidase（POD）andcatalase（CAT）weresignificantlylowerintransgenicplantsthanthoseinWT.（4）Additionally，therealtimequantitativeRTPCRshowedthattheexpressionlevelsofagingmarkergeneATSAG12，criticalsenescenceassociatedtranscriptionfactorsATNAP，ATWRKY6andchlorophylldegradationkeyenzymeencodinggeneATACD1increasedintransgenicplants.Insummary，transgenicA.thalianaexhibitedfasterleafsenescencecomparedwithWT，andtheexpressionofthesoybeanreceptorlikeproteinkinaseRLPK2geneplayedanimportantroleinpromotingleafsenescence.032BA245-D028-4DA2-A536-F4FF14202739

Keywords：soybeanRLPK2gene，leafsenescence，excitationpressure，antioxidantenzyme，malondialdehyde（MDA）

作為進(jìn)行光合作用的主要器官，葉片的生長(zhǎng)發(fā)育優(yōu)劣直接影響作物的生長(zhǎng)、產(chǎn)量及品質(zhì)。葉片衰老是葉片生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中的最終階段，它不是葉片細(xì)胞的簡(jiǎn)單死亡過(guò)程，而是一種主動(dòng)的、受細(xì)胞內(nèi)部遺傳程序控制的、器官水平上動(dòng)態(tài)的細(xì)胞程序性死亡過(guò)程，并且受到外部多種環(huán)境因素（光照、水分、溫度、礦質(zhì)元素和微生物）及內(nèi)部發(fā)育信號(hào)（激素、遺傳和基因調(diào)控）的協(xié)調(diào)控制（初夢(mèng)圓和于延沖，2019）。此外，葉片衰老還與Ca2+、糖、活性氧（relativeoxygenspecies，ROS）水平和內(nèi)源激素的變化等因素密切相關(guān)（張藝函等，2019）。葉片衰老主要表現(xiàn)為光合同化能力下降，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的退化，光合色素包括葉綠素和類胡蘿卜素的降解，蛋白質(zhì)和核酸降解，ROS與丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量增加，水解酶及生長(zhǎng)抑制因子持續(xù)增長(zhǎng)等，這些特征在多種植物中已有描述（Wooetal.，2013;Wangetal.，2016）。葉片衰老能夠增強(qiáng)植物對(duì)生存環(huán)境的適應(yīng)性，從而有利于其生存和延續(xù)。但對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)而言，植物過(guò)早衰老引起的葉片同化功能的減退也極大地影響和限制了農(nóng)作物產(chǎn)量潛力的發(fā)揮，導(dǎo)致作物品質(zhì)及產(chǎn)量的損失。因此，對(duì)葉片衰老機(jī)理的研究不僅在揭示植物的生態(tài)適應(yīng)等方面具有一定意義，還在糧食生產(chǎn)上抑制早衰具有重要意義。大豆在我國(guó)播種面積僅次于玉米、水稻、小麥和馬鈴薯，是第五大糧食作物，其含有豐富的植物蛋白質(zhì)，同時(shí)又可用來(lái)榨油，因此是我國(guó)重要的油料作物。相關(guān)研究表明，葉片早衰嚴(yán)重影響著大豆正常的生長(zhǎng)發(fā)育，并會(huì)引起產(chǎn)量及品質(zhì)的下降（呂林濤，2018）。鑒定大豆葉片衰老相關(guān)基因及其功能對(duì)于提高大豆的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)和育種改良具有重要的科學(xué)意義和深遠(yuǎn)的應(yīng)用價(jià)值。

植物類受體蛋白激酶（receptorlikeproteinkinase，RLKs）具有特殊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，在植物中普遍存在，占植物蛋白激酶總量的60%，是植物中較大的基因家族之一，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑過(guò)程，并在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境的適應(yīng)過(guò)程中具有重要作用（Shiu&Bleecker，2001）。其中，富含亮氨酸重復(fù)序列（leucinerichrepeat，LRRs）型類受體蛋白激酶是RLKs中最大的一個(gè)亞家族（Coletteetal.，2011）。迄今為止，LRRsRLKs蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和表達(dá)模式在擬南芥（阿依江·哈拜克等，2014）、煙草（曾建斌，2011）、花生（莊瑞蓉等，2018）、馬鈴薯（謝潔等，2019）等植物中均有研究。相關(guān)研究表明，LRRRLKs在植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用（Diévart&Clark，2004）。謝潔等（2019）發(fā)現(xiàn)馬鈴薯LRR類受體蛋白激酶SCLRRK1在低溫條件下表達(dá)受到抑制，證實(shí)其參與低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程。Zhou等（2016）發(fā)現(xiàn)LRRRLKs型基因調(diào)節(jié)擬南芥花藥的發(fā)育過(guò)程。作為L(zhǎng)RRRLKs家族中被研究較為廣泛的一員，BAK1在油菜素內(nèi)酯（BR）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（Heetal.，2007）、植物先天免疫反應(yīng)（韋莉等，2019）、細(xì)胞死亡調(diào)控（Zhouetal.，2019）等方面發(fā)揮作用。大豆RLPK2基因（GenBank登錄號(hào)：AY687391）是植物分子遺傳學(xué)研究組李小平副教授前期以大豆科豐34為材料篩選到的一個(gè)編碼N末端富含亮氨酸重復(fù)序列的類受體蛋白激酶基因，前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)人工誘導(dǎo)衰老處理顯著提高了該基因在大豆初生葉片中的轉(zhuǎn)錄水平，初步分析顯示該基因可能參與大豆葉片衰老的調(diào)控過(guò)程。本研究在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了大豆RLPK2基因過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片衰老進(jìn)程進(jìn)行分析，進(jìn)一步揭示該基因在植物葉片衰老中的功能，以期為延緩葉片衰老從而提高大豆作物產(chǎn)量和改善作物品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料及培養(yǎng)方法

本試驗(yàn)所使用的擬南芥（Arabidopsisthaliana）為哥倫比亞野生型（WT）擬南芥（Columbia0）。培養(yǎng)環(huán)境條件如下：溫度為20～25℃，光暗周期為16h光照/8h黑暗，光照強(qiáng)度為100SymbolmA@

mol·m2·s1，相對(duì)濕度為80%。

1.2總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

采用QIAGEN的植物RNA提取試劑盒RNeasyPlantMiniKit按照操作說(shuō)明提取大豆品種科豐34葉片總RNA，經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)（Merinton，美國(guó)）檢測(cè)其純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性后，利用Thermo公司提供的cDNA試劑盒按照反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書合成cDNA第一條鏈。

1.3RLPK2全長(zhǎng)cDNA引物設(shè)計(jì)及RTPCR基因擴(kuò)增

利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)RLPK2基因的特異性引物，根據(jù)Gateway技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體的要求，在引物5′端加上AAAAAGCAGGCTCG，引物序列如下：

RLPK2OXF：5′AAAAAGCAGGCTCGATGAGA

TCAGTAAGTTCCCCTG3′;

RLPK2OXR：5′AGAAAGCTGGGTTTTAATCT

CTCTTCTCCAAGTAAGAAG3′。

采用高保真PhusionDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性30s，35個(gè)循環(huán)（94℃30s，62℃30s，72℃30s），循環(huán)結(jié)束后72℃10min延伸反應(yīng)，4℃保溫。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，回收特異性目標(biāo)條帶，送樣測(cè)序，選取測(cè)序正確的克隆進(jìn)行后期載體的構(gòu)建。

1.4RLPK2過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建、擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及純合體篩選032BA245-D028-4DA2-A536-F4FF14202739

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將重組植物過(guò)表達(dá)載體pB2GW7轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，并將收取的種子種在含有20mg·L1的Basta的1/2MS培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性植株，提取T3代轉(zhuǎn)基因植株總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用特異性引物對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行RTqPCR鑒定，選取其進(jìn)行后續(xù)表型實(shí)驗(yàn)。

1.5葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

使用便攜式葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定儀（PAM2500，德國(guó)）測(cè)定100SymbolmA@

mol·m2·s1光強(qiáng)下植株葉片的穩(wěn)態(tài)熒光Fs、最大熒光Fm′和最小熒光Fo′后，將葉片暗適應(yīng)30min后，測(cè)定初始熒光Fo和暗下最大熒光Fm。根據(jù)測(cè)定的熒光參數(shù)計(jì)算得出光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）最大光化學(xué)效率Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm，實(shí)際光化學(xué)量子效率ΦPSⅡ=（Fm′-Fs）/Fm′，光化學(xué)淬滅系數(shù)qP=（Fm′-Fs）/（Fm′-Fo′），光合電子傳遞速率ETR=ΦPSⅡ×PPFD×A×0.5，式中：PPFD是光輻射通量;A是葉片吸收光能系數(shù)。

1.6MDA含量和抗氧化酶活性測(cè)定

取樣葉0.1g在液氮中充分研磨后立即轉(zhuǎn)入含有1mL50mmol·L1磷酸緩沖溶液（pH7.8，含1mmol·L1EDTA和1%PVP）的離心管中，在4℃下15000g離心15min，取上清液棄沉淀，再15000g離心5min，回收上清液用于MDA含量和抗氧化酶活性的測(cè)定?？寡趸富钚缘臏y(cè)定參照文獻(xiàn)（陳斌等，2015）。超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法;過(guò)氧化物酶（POD）活性檢測(cè)采用愈創(chuàng)木酚法;過(guò)氧化氫酶（CAT）活性檢測(cè)活性采用H2O2分解法測(cè)定。MDA含量的測(cè)定參考中國(guó)科學(xué)院上海植物生理研究所（1999）的方法。

1.7轉(zhuǎn)RLPK2基因擬南芥中衰老相關(guān)基因表達(dá)

RNA提取步驟同上，其反轉(zhuǎn)錄及定量PCR體系的配制均依據(jù)QuantRTPCRkit（SYBRGreen）的說(shuō)明書操作，具體數(shù)據(jù)分析參照Xue等（2017）步驟進(jìn)行。

1.8數(shù)據(jù)分析

所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用MicrosoftExcel2019軟件和IBMSPSS22.0軟件進(jìn)行處理，采用studentt檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)不同處理之間的差異顯著性（P<0.05，差異顯著）。采用SigmaPlot14.5軟件完成作圖。

2結(jié)果與分析

2.1超表達(dá)RLPK2基因促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥衰老

選取篩選得到的2個(gè)T3代純系進(jìn)行表型分析，首先通過(guò)RTPCR比較分析野生型及兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系OX1和OX2中的RLPK2的基因表達(dá)量。結(jié)果顯示野生型中未檢測(cè)到該基因，而兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中均有顯著的擴(kuò)增條帶，表明兩個(gè)轉(zhuǎn)基因純系確為RLPK2的超表達(dá)株系（圖1）。比較生長(zhǎng)4周時(shí)的野生型及轉(zhuǎn)基因株系的擬南芥表型，可見兩轉(zhuǎn)基因株系擬南芥的抽苔和開花時(shí)間較野生型明顯提前（圖1），表明RLPK2促進(jìn)擬南芥衰老進(jìn)程。

2.2MDA含量

在三個(gè)不同發(fā)育時(shí)期，轉(zhuǎn)RLPK2基因擬南芥植株葉片的MDA含量顯著高于WT擬南芥（圖2）。MDA是自由基作用于細(xì)胞膜脂發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物之一，能在一定程度上反映氧化脅迫是否發(fā)生以及發(fā)生的程度。結(jié)果表明，超表達(dá)RLPK2基因可以引起擬南芥發(fā)生氧化脅迫。

2.3抗氧化酶系

為深入分析RLPK2基因過(guò)表達(dá)對(duì)植株細(xì)胞抗氧化性狀的影響，分別檢測(cè)了三個(gè)不同發(fā)育時(shí)期WT和RLPK2轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片的SOD、POD和CAT酶活性，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在同一生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片的SOD、POD和CAT酶活性顯著低于WT。試驗(yàn)結(jié)果表明，超表達(dá)RLPK2基因使胞內(nèi)ROS清除系統(tǒng)的功能降低，從而導(dǎo)致膜系統(tǒng)受到傷害，并進(jìn)一步造成膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞。

2.4葉綠素?zé)晒?/p>

如圖4所示，無(wú)論是WT還是RLPK2轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在衰老的前期和中期葉片F(xiàn)v/Fm幾乎未變，然而在衰老末期，衰老導(dǎo)致了擬南芥葉片F(xiàn)v/Fm明顯降低，且轉(zhuǎn)基因擬南芥下降的更加明顯。在擬南芥葉片衰老過(guò)程中還有一個(gè)明顯的PSⅡ激發(fā)壓上升階段，且轉(zhuǎn)基因擬南芥比WT擬南芥上升更明顯，表明前者比后者電子流受阻嚴(yán)重。此外，PSⅡ光合電子傳遞量子效率ΦPSⅡ、光化學(xué)淬滅系數(shù)qP和光合電子傳遞速率ETR在擬南芥葉片衰老過(guò)程中均呈降低趨勢(shì)，且轉(zhuǎn)基因擬南芥下降更明顯，表明在生育后期衰老過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因型比野生型葉片的PSⅡ功能下降更快，并且具有較低的光能利用效率。

2.5超表達(dá)RLPK2基因?qū)M南芥衰老相關(guān)基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步研究RLPK2基因異源過(guò)表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥中各衰老相關(guān)基因和衰老轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量的影響，本研究利用RTPCR檢測(cè)衰老標(biāo)志基因ATSAG12，衰老關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ATNAP、ATWRKY6和葉綠素降解關(guān)鍵基因ATACD1的表達(dá)變化情況。與WT擬南芥相比，RLPK2基因異源過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了上述衰老相關(guān)基因的表達(dá)（圖5）。

3討論

除了作為信號(hào)分子介導(dǎo)植物對(duì)各種外界刺激的響應(yīng)之外，ROS還在植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育與分化以及細(xì)胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）等方面具有重要作用（Mittleretal.，2011;Perez&Brown.，2014;Wangetal.，2020）。O2-和H2O2是植物體內(nèi)主要的活性氧自由基，作為強(qiáng)氧化劑攻擊細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸或生物大分子物質(zhì)導(dǎo)致其透性增加，而MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，其積累會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定的傷害，其含量的變化是細(xì)胞質(zhì)膜損傷程度的重要標(biāo)志之一，同時(shí)也是衡量植物器官衰老時(shí)或在逆境條件下細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性的較好指標(biāo)（Slamaetal.，2015;夏冬冬等，2018）。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著葉片衰老進(jìn)程的進(jìn)行，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片MDA含量呈增加的趨勢(shì)，表明兩者細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度逐漸增加，細(xì)胞由完整變得破裂，造成細(xì)胞衰老和死亡。MDA含量增加可能與活性氧清除系統(tǒng)能力下降有關(guān)。在本研究中，盡管SOD酶活性在擬南芥葉片衰老過(guò)程中有所提高，但是由于POD酶和CAT酶活性降低，導(dǎo)致了其體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)能力下降，從而引起ROS大量累積，導(dǎo)致MDA含量增加;在擬南芥衰老的各個(gè)時(shí)期，在轉(zhuǎn)基因株系葉片中SOD、POD和CAT酶活性均顯著低于野生型，因而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因株系葉片MDA含量均相應(yīng)地顯著高于野生型。在植物葉片衰老過(guò)程中伴隨著與光合作用光反應(yīng)有關(guān)組分的降解（如葉綠素、類胡蘿卜、葉黃素及Cytf等）（Hikosakaetal.，1996;Murchieetal.，1999），同時(shí)也伴隨著與光合作用暗反應(yīng)有關(guān)過(guò)程的衰退（如Rubisco活性下降、Rubisco降解及氣孔導(dǎo)度下降等）（Onoetal.，2013;Majeranetal.，2019）以及光合速率的下降。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，衰老引起葉綠體的結(jié)構(gòu)、大小以及類囊體膜的完整性發(fā)生變化（Hashimotoetal.，1989），正是這種變化最終導(dǎo)致葉片衰老過(guò)程中PSI和PSⅡ的活性都下降。然而相對(duì)而言，PSⅡ?qū)λダ细鼮槊舾校℅rover&Mohanty，1993）。PSⅡ的葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)可直觀反映植物葉片光合作用過(guò)程中光系統(tǒng)對(duì)光能的吸收、轉(zhuǎn)化、耗散及分配等。作為其中一個(gè)比較重要的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，F(xiàn)v/Fm是暗適應(yīng)下PSⅡ反應(yīng)中心完全開放時(shí)032BA245-D028-4DA2-A536-F4FF14202739

的最大光化學(xué)效率，代表了植物潛在的最大光合能力，正常生理狀態(tài)下其數(shù)值通常介于0.80～0.85之間，并且基本上不受物種的影響。在植物體遭受到光抑制、逆境脅迫或者發(fā)生某些與光合相關(guān)的基因突變時(shí)，F(xiàn)v/Fm會(huì)發(fā)生顯著性變化（肖華貴等，2013）。前人在研究不同種類作物衰老進(jìn)程時(shí)均發(fā)現(xiàn)，盡管作物葉片衰老過(guò)程中光合作用能力下降，但是衰老并未引起PSⅡFv/Fm明顯下降（高海濤等，2010;武永勝等，2010）。因此，有學(xué)者根據(jù)這一數(shù)據(jù)認(rèn)為植物葉片衰老過(guò)程中PSⅡ活性并未發(fā)生相應(yīng)變化。本研究結(jié)果表明，在衰老的前期和中期，衰老確實(shí)未導(dǎo)致擬南芥葉片F(xiàn)v/Fm明顯下降;然而在衰老的末期，衰老導(dǎo)致了擬南芥葉片F(xiàn)v/Fm明顯降低，且轉(zhuǎn)基因擬南芥下降得更加明顯。PSⅡ激發(fā)壓（1qP）是對(duì)PSⅡ的電子接受體QA的氧化還原狀態(tài)的估計(jì)值，其反映了PSⅡ的氧化還原狀況以及能量供應(yīng)和利用之間的平衡，能量平衡是通過(guò)光合電子傳遞鏈組分的氧化還原狀態(tài)所介導(dǎo)的（Huneretal.，1998）。前人研究發(fā)現(xiàn)PSⅡ激發(fā)壓（1qP）可能分別介導(dǎo)了自然衰老和缺氮引起的早衰（Tangetal.，2015;Wangetal.，2015）。Misra等（2011）認(rèn)為PSⅡ激發(fā)壓可以用作監(jiān)測(cè)衰老開始的傳感器。Ou等（2003）研究發(fā)現(xiàn)超高產(chǎn)水稻劍葉衰老的過(guò)程中有一個(gè)明顯的PSⅡ激發(fā)壓上升的階段，顯示光合電子流傳遞受阻。本研究同樣也發(fā)現(xiàn)在擬南芥葉片衰老過(guò)程中有一個(gè)明顯的PSⅡ激發(fā)壓上升的階段，且轉(zhuǎn)基因型比野生型擬南芥上升更加明顯，表明轉(zhuǎn)基因型比野生型擬南芥電子流受阻程度更嚴(yán)重。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)在擬南芥葉片衰老過(guò)程中，PSⅡ光合電子傳遞量子效率ΦPSⅡ、光化學(xué)淬滅系數(shù)qP和光合電子傳遞速率ETR均降低，且轉(zhuǎn)基因擬南芥下降更加明顯，這一結(jié)果表明在生育后期衰老的過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因株系較野生型葉片的PSⅡ功能下降更快，并且具有較低的光能利用效率。

本研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量RTPCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RLPK2基因超表達(dá)導(dǎo)致葉綠素降解關(guān)鍵酶編碼基因ACD1表達(dá)量增加，這暗示了超表達(dá)RLPK2基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因擬南芥葉綠素降解速率加快，光合作用能力下降?，F(xiàn)有研究表明，擬南芥中衰老標(biāo)志基因ATSAG12編碼半胱氨酸蛋白酶僅在只依賴于葉齡發(fā)育信號(hào)而導(dǎo)致的衰老過(guò)程中表達(dá)，且表達(dá)量不受其他脅迫信號(hào)的影響（張藝函等，2019）。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在衰老中期才能在野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中檢測(cè)到該基因的表達(dá)，且超表達(dá)RLPK2基因顯著促進(jìn)其表達(dá)量，揭示RLPK2基因在葉片衰老過(guò)程中響應(yīng)葉齡發(fā)育信號(hào)。在葉片衰老過(guò)程中，WRKY和NAC等轉(zhuǎn)錄因子家族成員中大部分成員表達(dá)量上調(diào)，參與調(diào)控葉片衰老過(guò)程，在葉片衰老過(guò)程中具有關(guān)鍵作用（Shahetal.，2014）。在本研究中，超表達(dá)RLPK2基因顯著促進(jìn)ATWRKY6和ATNAP表達(dá)量的提升，表明RLPK2基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些葉片衰老的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子而參與到葉片衰老的調(diào)控。

4結(jié)論

大豆RLPK2受體蛋白激酶基因可參與植物葉片衰老調(diào)控過(guò)程，其過(guò)表達(dá)株系可通過(guò)調(diào)控衰老進(jìn)程中抗氧化酶活性的變化，增加過(guò)氧化物的積累，導(dǎo)致PSⅡ功能衰退較快，以及調(diào)控衰老相關(guān)基因如衰老標(biāo)志基因ATSAG12、衰老關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ATNAP、ATWRKY6和葉綠素降解關(guān)鍵酶編碼基因ATACD1的表達(dá)，從而促進(jìn)受體植株的早衰，但其調(diào)控衰老的機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯李莉）

收稿日期：2020-10-11

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金（1608085MC49）;安徽省高校自然科學(xué)基金（KJ2018A0403）;資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目。

第一作者：張強(qiáng)（1976-），博士，副教授，研究方向?yàn)槟婢持参锷砩鷳B(tài)學(xué)，（Email）zhangq@foxmail.com。

通信作者：薛濤，博士，副教授，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究，（Email）xuetao_26@163.com。032BA245-D028-4DA2-A536-F4FF14202739