銀蓮花的抗氧化、抑菌和抗腫瘤活性

李建飛，王俊麗，公維鎮(zhèn)，費(fèi)良丹，劉金豆

（中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081）

銀蓮花（Anemonecathayensis）為毛茛科（Ranunculaceae）銀蓮花屬（Anemone）植物，在我國(guó)分布于山西、河北等地，海拔高度為1 000～1 600m，主要生長(zhǎng)于山坡草地、山谷溝邊或多石礫坡地.朝鮮也有分布［1］.銀蓮花屬許多植物為中國(guó)傳統(tǒng)中藥材，在民間人們將阿爾泰銀蓮花、西南銀蓮花、多被銀蓮花、鵝掌草、野棉花等作為消炎［2］、鎮(zhèn)痛、抗菌［3］、驅(qū)蟲(chóng)等藥物使用，《中華人民共和國(guó)藥典》已將多被銀蓮花的根莖收載，用于祛風(fēng)濕、消癰腫，同時(shí)還可治療骨節(jié)疼痛、癰腫潰爛、風(fēng)寒濕痹等癥［4］.

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)銀蓮花屬植物的生物活性研究主要集中于銀蓮花素A抗癌活性的研究［5－10］，對(duì)其抗氧化活性和抑菌活性的研究很少.本研究主要通過(guò)DPPH法研究銀蓮花乙醇提取物不同組分的抗氧化活性，通過(guò)抑菌圈法探究不同組分對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、大腸桿菌（Esherichiacoli）和枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）抑菌活性，通過(guò)MTT法研究不同組分及分離到的3－氧－2，23－二羥基－齊敦果－12－烯－28－酸等10個(gè)不同單體化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用.

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

銀蓮花植株采自北京靈山海拔2 200m處陽(yáng)坡.取1.5kg全草干品，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇閃式提取，合并減壓蒸干得粗提物.組分Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ分別是石油醚與丙酮體積比為5∶1，3∶1，2∶1，1∶1時(shí)和純丙酮層經(jīng)過(guò)硅膠柱梯度洗脫所得浸膏.10個(gè)單體化合物分別為3－氧－2，23－二羥基－齊敦果－12－烯－28－酸（1），28－羥基－齊敦果－12－烯－3，11－二酮（2），3－甲氧基－齊敦果－11－酮－18－烯（3），熊果酸（4），α－香樹(shù)脂醇（5），28－羥基－α－香樹(shù)脂醇（6），2α，23－二羥基－熊果酸（7），香豆素（8），4，7－二甲氧基－5－甲基香豆素（9），槲皮素－7－O－鼠李糖苷（10），其分離方法參見(jiàn)文獻(xiàn)［11］.

所用腫瘤細(xì)胞為人乳腺腫瘤細(xì)胞（MDA－MB－231）；所用菌種分別為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Esherichiacoli）和枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），均由本實(shí)驗(yàn)室保藏.

1.2 方法

1.2.1 抗氧化活性測(cè)定

參照Kirby和Schmidt方法［12］.200μL反應(yīng)體系中包含：各種不同待測(cè)樣品100μL（用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶解），60μmol DPPH（SIGMA－ALDRICH，批號(hào)：S90790－379）乙醇溶液100μL.于酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）中振動(dòng)搖勻，暗反應(yīng)30min后，用酶標(biāo)儀在517nm下測(cè)量吸光度（A）.維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)照組和處理組都重復(fù)3次.自由基清除活性的計(jì)算公式如下［13］：抑制率＝［（A對(duì)照－A樣品）／A對(duì)照］×100%.用SPSS17.0版本的相關(guān)功能計(jì)算其半數(shù)抑制濃度

1.2.2 抑菌活性的測(cè)定

1.2.2.1 菌懸液制備和培養(yǎng)基的配制

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌接種培養(yǎng)（37℃的搖床上活化培養(yǎng)24h）后，用無(wú)菌生理鹽水稀釋成含菌量為106～108／mL的菌懸液備用.

在每個(gè)直徑為90mm的培養(yǎng)皿中加入蛋白胨培養(yǎng)基約10mL，冷凝，再取0.2mL菌懸液加入到10mL 45℃左右的培養(yǎng)基中，充分混合后，倒入上述培養(yǎng)基表面，待其凝固后，用打孔器在培養(yǎng)基上打孔，孔徑為6mm.

1.2.2.2 抑菌活性的測(cè)定

分別將不同質(zhì)量濃度的組分Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ甲醇溶液各20μL加入到小孔中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察并測(cè)量抑菌圈的直徑.以注射用青霉素鈉作為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌水作為陰性對(duì)照.

1.2.3 抗腫瘤活性研究

1.2.3.1 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)

將人乳腺腫瘤細(xì)胞（MDA－MB－231）接種于含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、100u／mL青霉素、100u／mL鏈霉素雙抗RMPI－1640培養(yǎng)基上，置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h.

加入適量培養(yǎng)基，將腫瘤細(xì)胞懸液稀釋至1×105／mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL（約含1×104個(gè)細(xì)胞）.置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h.

1.2.3.2 抗腫瘤活性檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)組各孔分別加入質(zhì)量濃度為1，500，250，125，62.5μg／mL的不同組分和單體的甲醇溶液各100μL，每個(gè)劑量組重復(fù)3次；以表阿霉素（輝瑞制藥無(wú)錫有限公司）作為陽(yáng)性對(duì)照，將其配制成質(zhì)量濃度為1μg／mL的溶液，每個(gè)對(duì)照孔加入20μL；以RMPI－1640完全培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，每組重復(fù)3次.將培養(yǎng)物置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，各培養(yǎng)孔中加入MTT 20μL，再培養(yǎng)4h，棄上清液，每孔加入DMSO 100μL，充分振蕩混合10min.通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（OD值），檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm.為保證實(shí)驗(yàn)不被污染，采用0.2μm無(wú)菌濾器對(duì)各種試劑進(jìn)行除菌處理.

1.2.3.3 腫瘤細(xì)胞抑制率的計(jì)算

不同組分和單體化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率按如下公式計(jì)算.抑制率（CI）＝［（空白對(duì)照組的OD值－實(shí)驗(yàn)組的OD值）／空白對(duì)照組的OD值］×100%.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組分的抗氧化活性

2.1.1 DPPH自由基清除率

分析發(fā)現(xiàn)，各組分均有不同程度的自由基清除活性，且清除率與樣品的質(zhì)量濃度正向相關(guān)，在質(zhì)量濃度為100μg／mL時(shí)，組分Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ消除率分別為74.9%，43.3%，33.0%，55.1%和22.8%.其中組分Ⅰ的清除率最高（74.9%），組分Ⅴ清除率最低，僅有22.8%（圖1）.與陽(yáng)性對(duì)照維生素C（VC）相比，各組分抗氧化活性均低于VC.

圖1 5種不同組分對(duì)DPPH自由基的消除率Fig.1 DPPH radical scavenging activities of different fractions

表1 5種不同組分的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度Tab.1 IC50Value of 5different fractionsμg·mL－1

由表1可知，組分Ⅰ的抗氧化活性最好，對(duì)DPPH自由基的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50為30.58μg／mL.各組分的IC50值由小到大依次為Ⅰ＜Ⅳ＜Ⅱ＜Ⅲ＜Ⅴ.組分的IC50值越小，表明其抗氧化能力越強(qiáng)，不同組分的抗氧化能力由強(qiáng)到弱依次為Ⅰ＞Ⅳ＞Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅴ.

2.2 抑菌活性

不同質(zhì)量濃度的5種組分對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌效果如表2.

表2 5種不同組分的抑菌活性Tab.2 Antimicrobial activities of 5different fractions

從表2可以看出，組分Ⅴ抑菌活性最強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為40mg／mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌、枯草芽抱桿菌、金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，當(dāng)質(zhì)量濃度降低到10mg／mL時(shí)對(duì)3種菌仍表現(xiàn)出抑制作用.組分Ⅲ在質(zhì)量濃度為40mg／mL時(shí)對(duì)3種菌也表現(xiàn)出明顯的抑制作用，在質(zhì)量濃度為160mg／mL時(shí)抑制性最強(qiáng)，金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為13mm，大腸桿菌抑菌圈直徑12mm，枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為14mm.80mg／mL的組分Ⅳ對(duì)枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出一定的抑制活性，但對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌沒(méi)有明顯的抑制作用.組分Ⅰ和組分Ⅱ抑菌活性最差，它們對(duì)3種菌的抑制作用均不明顯.

2.3 抗人乳腺腫瘤細(xì)胞活性

2.3.1 5種不同組分對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率

通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ5種不同組分質(zhì)量濃度為100μg／mL時(shí)，對(duì)人乳腺腫瘤細(xì)胞（MDAMB－231）抑制率分別為31.79%，50.32%，37.69%，43.65%和29.47%（圖2）.表阿霉素對(duì)其抑制作用十分明顯，雖然加入量很少（20ng），但對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率高達(dá)69.08%.

由圖2可以看出，各個(gè)組分對(duì)人乳腺腫瘤細(xì)胞（MDA－MB－231）均有一定的抑制作用，其抗腫瘤活性從高到低依次為Ⅱ＞Ⅳ＞Ⅲ＞Ⅰ＞Ⅴ，其中組分Ⅱ的抑制活性最高，達(dá)到了50.32%.雖然這5種組分對(duì)人乳腺腫瘤細(xì)胞均有一定的抑制活性，但是與陽(yáng)性對(duì)照表阿霉素相比，活性明顯偏弱.

2.3.2 不同單體化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率

研究發(fā)現(xiàn)，單體化合物8，9和10對(duì)人乳腺腫瘤細(xì)胞沒(méi)有明顯抑制作用，化合物1～7均有一定的抗腫瘤細(xì)胞活性.當(dāng)質(zhì)量濃度為100μg／mL時(shí)，這7種單體化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率分別達(dá)到26.41%，37.80%，33.17%，20.38%，18.31%，16.20%和22.48%，其中化合物2（28－羥基－齊敦果－12－烯－3，11－二酮）對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性最明顯（圖3）.

圖2 5種不同組分對(duì)MDA－MB－231腫瘤細(xì)胞的抑制率Fig.2 Inhibition activity of different fractions on human breast cancer cells

圖3 10種單體化合物對(duì)MDA－MB－231腫瘤細(xì)胞的抑制率Fig.3 Inhibition activity of different compounds extracted on human breast cancer cells

3 討論

盛俠［15］研究結(jié)果表明，齊墩果酸對(duì)DPPH自由基有一定的抑制作用，并且隨著齊墩果酸質(zhì)量濃度的增大，其對(duì)自由基的抑制率明顯提高，當(dāng)齊墩果酸為1.0mg／mL時(shí)對(duì)DPPH自由基的抑制率達(dá)到60.86%.本研究發(fā)現(xiàn)，組分I的抗氧化活性最高，其中是否為齊墩果酸類化合物起主要作用，需要進(jìn)一步的研究.

蘇波［16］研究毛茛皂苷的抑菌活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，毛茛皂苷對(duì)綠膿桿菌、糞腸球菌、產(chǎn)氣腸球菌、金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，而對(duì)大腸桿菌、藤黃八疊球菌、枯草芽孢桿菌、副甲硫桿菌、雞沙門(mén)氏菌5種菌株沒(méi)有明顯的生長(zhǎng)抑制性.白宇明［17］發(fā)現(xiàn)，金蓮花是一種抑菌普很廣的中草藥，其提取物在體外對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有較好的抑菌活性.林晨等［18］發(fā)現(xiàn)，金蓮花不同提取物抑菌效果不同.水提物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為3.0mg／mL，體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇提取物對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC是31.3mg／mL，體積分?jǐn)?shù)為60%和90%的乙醇提取物對(duì)大腸桿菌的MIC是125.0mg／mL.本研究發(fā)現(xiàn)，組分Ⅴ和Ⅲ在質(zhì)量濃度為80mg／mL時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有抑制作用，這進(jìn)一步說(shuō)明毛茛科銀蓮花屬植物可作為一種很好的抗菌資源植物.

鄭開(kāi)波等［19］、張東方等［20］研究發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸對(duì)人口腔鱗癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞具有一定的抑制作用，并且對(duì)正常細(xì)胞毒性較小.王丹丹等［21］研究結(jié)果表明，齊墩果酸及其衍生物對(duì)肺癌細(xì)胞均有抑制作用，3－氧代齊墩果酸的抑制活性最強(qiáng)，其抑制率高達(dá)90.0%，IC50為24.2μg／mL.本研究結(jié)果表明，齊墩果酸還對(duì)人乳腺腫瘤細(xì)胞（MDA－MB－231）具有一定的抑制作用，說(shuō)明該化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用具有廣譜性.

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