利福平／OCS－PLGA納米緩釋微球的制備及體外釋放性能

李彥艷，任國棟，柳峰松，魏建榮

（河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002）

聚合物膠束是兩親性聚合物在選擇性溶液中形成的具有親水性外殼和疏水性內(nèi)核的膠束體系，具有低臨界膠束濃度、高度熱力學(xué)穩(wěn)定性、長循環(huán)、增溶藥物、緩釋、靶向等功能，已成為一種新型藥物傳遞系統(tǒng)［1］.聚合物膠束載藥體系的制備，可通過化學(xué)結(jié)合法、物理法和靜電作用3種途徑包埋藥物［2－4］，其中物理包埋法操作簡(jiǎn)單，載藥范圍很廣.

殼聚糖（chitosan，CS）［（1，4）－2－氨基－2－脫氧－β－D－葡聚糖］，具有良好的生物可降解性、生物相容性、無免疫活性等特點(diǎn)，近年來被廣泛地應(yīng)用于藥物傳遞系統(tǒng)［5］.在殼聚糖分子中引入疏水長鏈?zhǔn)蛊涑蔀橐环N兩親性聚合物，在水溶液中可以自動(dòng)聚集成膠束［6－8］.但是所形成的膠束是一個(gè)動(dòng)態(tài)體系，藥物與疏水性內(nèi)核的作用僅依賴于較弱的分子間作用力，如范德華力、氫鍵、靜電引力等，因此在體內(nèi)很容易松散、解離甚至藥物滲漏、暴釋，有待進(jìn)一步改善.

利福平（RFP）為一類抗生素類藥物，是目前臨床應(yīng)用最廣泛的一種抗結(jié)核病藥物，對(duì)革蘭氏陰性菌和陽性菌有明顯的抗菌作用.在臨床上可用作肝炎、肺炎等，但如果口服劑量過大，往往有毒副作用，引起不良反應(yīng)等.用殼聚糖膠束包裹利福平制成納米微球，可以做成皮下埋植或靜脈注射制劑，可減緩藥物釋放，提高療效.

本文對(duì)殼聚糖進(jìn)行化學(xué)修飾得到兩親性聚合物油酰殼聚糖，用乳化溶劑蒸發(fā)法制備油酰殼聚糖包被的聚乙丙交酯（PLGA）納米微球.PLGA的加入是為了增加載藥納米微球的穩(wěn)定性和釋放時(shí)的物理屏障，PLGA是一種可生物降解、吸收的高分子聚合物.檢測(cè)了納米微球形態(tài)、穩(wěn)定性等特征.用疏水性藥物利福平做為模型藥物，檢測(cè)了納米微球制備過程中一些因素如PLGA濃度、OCS濃度等對(duì)納米微球包封率和釋藥效果的影響，進(jìn)一步分析納米微球形態(tài)與釋放方式、釋放速度的相關(guān)性，為殼聚糖在醫(yī)用緩釋材料領(lǐng)域的應(yīng)用方面提供了依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

殼聚糖（分子質(zhì)量38ku，脫乙酰度85%）；PLGA（50－150，分子質(zhì)量60ku）；透析袋（截留分子質(zhì)量10 000～14 000ku）；利福平（浙江江北制藥廠）；其他試劑均為分析純?cè)噭?

1.2 儀器

均質(zhì)機(jī)（PRO Scientific Inc）；掃描電鏡（SEM，JSM－T330A，Nihon Denshi，Japan）；恒溫磁力振蕩器（上海智誠分析儀器有限公司）；T6紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用）；LGJ0－5冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）.

1.3 方法

1.3.1 油酰殼聚糖包被的PLGA納米微球制備

油酰殼聚糖的制備采用油酰氯和殼聚糖反應(yīng)［9］.

準(zhǔn)確稱量一定量PLGA溶于二氯甲烷中（油相）；一定量油酰殼聚糖溶于體積分?jǐn)?shù)0.5%的乙酸溶液中，得到油酰殼聚糖溶液（水相）；待PLGA在二氯甲烷中完全溶解后，將油相加入到水相中；以16 000r／min的速率均質(zhì)20min，得到納米微球懸浮液.納米微球干粉為將納米微球離心后冷凍干燥方法制備.載利福平納米微球的制備為先將利福平和PLGA一起溶解在二氯甲烷中，其他操作同上.

1.3.2 紅外光譜檢測(cè)

樣品在50℃條件下真空干燥10h后，將2mg OCS包被的PLGA納米微球與KBr充分研磨混勻，用壓片機(jī)制成樣品，然后用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000cm－1對(duì)樣品進(jìn)行分析.

1.3.3 微球形態(tài)觀察

將所制備的納米微球干粉用SEM檢測(cè)以觀察形態(tài).

1.3.4 微球載藥效率測(cè)定

微球的包封率和載藥量測(cè)定方法見文獻(xiàn)［10］.

1.3.5 體外釋放實(shí)驗(yàn)

利福平體外釋放實(shí)驗(yàn)方法見文獻(xiàn)［11］，根據(jù)利福平標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量，并補(bǔ)以同樣體積的緩沖溶液以保持總體積不變.每個(gè)樣品測(cè)定做3個(gè)平行，取平均值.釋放介質(zhì)分別為pH 3.8醋酸緩沖液和pH 6.8磷酸緩沖液.

1.3.6 微球緩釋效果的優(yōu)化

通過改變OCS和PLGA濃度、釋放介質(zhì)pH等條件下，檢測(cè)微球各項(xiàng)指標(biāo)和阿霉素體外釋放效果，探討OCS－PLGA NPs微球形態(tài)與緩釋效果的相關(guān)性.

2 結(jié)果

2.1 納米微球的形成

聚合物膠束的制備方法有透析法、直接溶解法、自組裝溶劑蒸發(fā)等方法［12］.經(jīng)過疏水修飾的油酰殼聚糖是一種兩親性聚合物，在水溶液中能夠自聚集成納米膠束，這種膠束在水性環(huán)境中其疏水基團(tuán)聚集形成疏水性內(nèi)核并被親水性鏈段構(gòu)成的柵欄所包圍.將油酰殼聚糖溶解于水得到水相，PLGA溶解于有機(jī)溶劑得到油相，在乳化作用下就會(huì)形成以包含有PLGA的有機(jī)溶劑為核心，油酰殼聚糖疏水基指向核心，親水基指向水溶液的結(jié)構(gòu).將有機(jī)溶劑二氯甲烷蒸發(fā)除去，PLGA留在了疏水內(nèi)核中，PLGA的存在會(huì)增加藥物釋放時(shí)的屏障和物理阻力，降低藥物釋放速度.

2.2 紅外圖譜

圖1所示的是OCS納米微球和OCS包被的PLGA納米微球的紅外圖譜.從圖1可以看出，OCS納米微球（圖1a）在1 182cm－1（CH2），1 464cm－1（δCH2），2 854cm－1（νsCH2），2 924cm－1（νsCH2）有較強(qiáng)的特征吸收峰，說明在OCS分子中—CH2數(shù)量較多.OCS包被的PLGA納米微球（圖1b）紅外圖譜與OCS納米微球發(fā)生了很大的變化，出現(xiàn)了PLGA的特征吸收峰：1 100cm－1（C—O），1 750cm－1（═C O），2 400cm－1，3 326cm－1（C—H）.可以看出微球具有各種材料的特征吸收峰.

圖1 OCS包被的PLGA納米微球的紅外圖譜Fig.1 FT－IR of OCS nanoparticles and OCS－coated PLGA NPs

2.3 納米微球形態(tài)檢測(cè)

圖2所示的是OCS包被的PLGA納米微球的掃描電子顯微鏡照片.掃描電鏡顯示：所制備的OCS包被的PLGA納米微球密度較大，且粒徑在納米尺度；微球形態(tài)規(guī)整，分布較窄，表面光滑，沒有明顯的小孔、裂紋；微球之間有一定的粘連.

圖2 OCS包被的PLGA納米微球的掃描電子顯微鏡照片F(xiàn)ig.2 SEM images of OCS－coated PLGA NPs

2.4 微球載藥效率

表1所示的是PLGA質(zhì)量濃度對(duì)包封率和載藥量的影響.從表1可以看出，所制備的載藥納米微球具有較高的包封率和載藥量，包封率能達(dá)到80%以上，PLGA質(zhì)量濃度對(duì)納米微球?qū)FP的包封率的影響不大.

表1 不同PLGA質(zhì)量濃度的微球負(fù)載RFP的載藥量和包封率Tab.1 Drug loading and encapsulation efficiency of RFP－loaded OCS－coated PLGA NPs with different PLGA mass concentrations

表2所示的是OCS質(zhì)量濃度對(duì)包封率和載藥量的影響.從表2中可以看出，隨著OCS質(zhì)量濃度的增大包封率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這是由于OCS質(zhì)量濃度的增加導(dǎo)致利福平載體數(shù)量增加，因而包封率隨之增大.

表2 不同OCS質(zhì)量濃度的微球負(fù)載RFP的載藥量和包封率Tab.2 Drug loading and encapsulation efficiency of RFP－loaded OCS－coated PLGA NPs with different OCS concentrations

2.5 體外釋藥實(shí)驗(yàn)

PLGA質(zhì)量濃度對(duì)所形成的納米微球的釋藥影響如圖3所示.從圖3可以看出，隨著PLGA質(zhì)量濃度的增加，RFP釋放減慢.不加PLGA的納米微球36h釋放了59.12%，PLGA質(zhì)量濃度為0.65g／L的樣品36h釋放了46.08%，PLGA質(zhì)量濃度為2.00g／L的納米微球36h釋放了35.46%.說明PLGA的加入具有很好的增加藥物緩釋效果.

PLGA的加入改變了疏水性內(nèi)核的構(gòu)造，在內(nèi)核中形成網(wǎng)絡(luò)狀屏障，從而降低了藥物的釋放速度.當(dāng)PLGA質(zhì)量濃度較大時(shí)，所形成的疏水內(nèi)核中PLGA含量增高，當(dāng)藥物釋放時(shí)，對(duì)藥物的物理屏障作用增強(qiáng)，因此緩釋效果增強(qiáng).

OCS質(zhì)量濃度對(duì)所形成的納米微球的釋藥影響如圖4所示.從圖4可知，OCS質(zhì)量濃度越大的微球，藥物釋放速度越慢.OCS質(zhì)量濃度為1.00，2.00，3.00g／L的載藥納米微球36h分別釋放了52.87%，46.08%，39.13%.

圖3 PLGA質(zhì)量濃度對(duì)RFP載藥微球體外釋放的影響Fig.3 Mean percent drug release of RFP from OCS－coated PLGA NPs with different PLGA mass concentrations

圖4 OCS質(zhì)量濃度對(duì)RFP載藥微球體外釋放的影響Fig.4 Mean percent drug release of RFP from OCS－coated PLGA NPs with different OCS mass concentrations

OCS質(zhì)量濃度增大引起藥物緩釋效果增強(qiáng)的原因主要有2個(gè)：1）OCS分子中具有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)，有一定的表面活性，可以降低乳滴的表面自由能.表面活性劑可以在所形成的液滴表面形成一層保護(hù)膜，從而防止小液滴聚集成大液滴，使體系中的液滴保持在穩(wěn)定、細(xì)小、均勻的狀態(tài)；2）隨著OCS濃度增大，形成的膠束的外殼的厚度和致密性增強(qiáng).因此，OCS質(zhì)量濃度增大，增加了納米微球的穩(wěn)定性，也增加了納米微球外殼的厚度和致密性，增強(qiáng)了藥物釋放過程中的物理屏障，降低了藥物釋放速度.

圖5所示的是釋放介質(zhì)pH對(duì)RFP載藥微球體外釋放的影響.從圖5可知，RFP在pH3.8的釋放介質(zhì)中的釋放，比在pH6.8的介質(zhì)中釋放慢.在pH6.8和3.8介質(zhì)中達(dá)到平衡的時(shí)間分別為10h和34h.

OCS的溶解性與CS類似，由于氨基的質(zhì)子化，使得它們?cè)诘陀趐H6.5條件下溶解性較好，高于此pH條件溶解性較差.因此制得的微球在pH6.8條件下比在pH3.8條件下穩(wěn)定性差，微球中藥物就容易釋放出來.

圖5 釋放介質(zhì)pH對(duì)RFP載藥微球體外釋放的影響Fig.5 Mean percent drug release of RFP from OCS－coated PLGA NPs with different pH

3 討論

聚合物膠束可做為一種藥物載體，不同形態(tài)的膠束作為藥物載體具有不同的釋放原理與釋放方式，是近年來的研究熱點(diǎn).

本文對(duì)殼聚糖進(jìn)行化學(xué)修飾，制備了兩親性聚合物油酰殼聚糖（OCS）.通過乳化溶劑蒸發(fā)法制備了OCS包被的PLGA納米微球，所制備的納米微球具有較好的穩(wěn)定性，掃描電鏡觀察微球，發(fā)現(xiàn)微球粒徑在納米尺度，微球密度較大；微球形態(tài)規(guī)整，分布較窄，表面光滑，沒有明顯的小孔、裂紋.

選擇利福平作為模型藥物，并檢測(cè)了PLGA和OCS質(zhì)量濃度對(duì)包封率和體外釋藥的影響.所制備的納米微球具有較高的包封率和載藥量，隨著OCS質(zhì)量濃度的增大載藥量呈現(xiàn)上升趨勢(shì).隨著PLGA質(zhì)量濃度的增加，RFP釋放減慢.這是因?yàn)镻LGA的加入改變了疏水性內(nèi)核的構(gòu)造，在內(nèi)核中形成網(wǎng)絡(luò)狀屏障，從而降低了藥物的釋放速度.OCS質(zhì)量濃度越大的微球，藥物釋放速度越慢.這是因?yàn)镺CS質(zhì)量濃度增大，增加了納米微球的穩(wěn)定性，也增加了納米微球外殼的厚度和致密性，增強(qiáng)了藥物釋放過程中的物理屏障，降低了藥物釋放速度.RFP在pH6.8釋放介質(zhì)中的釋放，比在pH3.8的介質(zhì)中釋放快.

所制備的OCS包被的PLGA納米微球具有較穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)，較好的緩釋效果，并且隨著PLGA和OCS質(zhì)量濃度的增加緩釋效果增強(qiáng).

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