氟滅酸對豚鼠微動脈平滑肌細(xì)胞間縫隙連接的抑制作用＊

張治平，司軍強，李新芝，李 麗，趙 磊，魏麗麗，于秀石，馬克濤△

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院：1.生理學(xué)教研室；2.病理生理學(xué)教研室，新疆石河子832002）

氟滅酸（flufenamic acid，F(xiàn)FA）是臨床常見的非甾體抗炎藥物，研究發(fā)現(xiàn)氟滅酸能夠阻斷Cl－通道［1－2］、調(diào)節(jié)非選擇性陽離子通道［3－4］，還可以抑制培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞間的縫隙連接通道［5］。本實驗主要研究氟滅酸對急性分離的微動脈細(xì)胞間縫隙連接通道的電生理特性影響。許多組織和器官上都表達(dá)有縫隙連接存通道，是細(xì)胞間進行電化學(xué)信息通訊的直接途徑［6－7］?？p隙連接通道由相鄰的兩個細(xì)胞各提供一個連接子對接而成，每個連接子由6個不同或相同的連接蛋白（connexin，Cx）構(gòu)成，縫隙連接通道的孔徑約1.5nm，允許相對分子量小于1KD的分子通過。目前發(fā)現(xiàn)超過20種Cx表達(dá)在不同的細(xì)胞［6，8］。

縫隙連接在維持人體正常生理功能中扮演著重要角色，在血管舒縮運動中更為突出［9－13］。調(diào)節(jié)血管舒縮運動的電、化學(xué)信息在平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間傳遞，以及平滑肌細(xì)胞的同步化都需要縫隙連接功能和結(jié)構(gòu)的完整性［9，14］。為了研究縫隙連接在生理和病理生理狀態(tài)下所發(fā)揮的作用，特異性縫隙連接阻斷劑是必不可少的。有報道發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的細(xì)胞上氟滅酸能夠抑制細(xì)胞間的縫隙連接通訊［5］，但在急性分離的血管段標(biāo)本上尚未見相關(guān)報道。本實驗采用微動脈段全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在急性分離的腦動脈（brain？artery，BA）和腸系膜動脈（mesenteric artery，MA）上，研究氟滅酸對血管平滑肌細(xì)胞間縫隙連接通道電生理特性的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗所用豚鼠（新疆維吾爾自治區(qū)疾病控制中心動物飼養(yǎng)科提供，動物質(zhì)量符合一級標(biāo)準(zhǔn)）雌雄不限，體質(zhì)量約200～300g，麻醉狀況下放血處死，迅速取出腸系膜和腦，置于生理鹽溶液中，生理鹽溶液成分如下：NaCl 138.0mmol／L，KCl 5.0mmol／L，CaCl21.6mmol／L，MgCl21.2mmol／L，Na－HEPES 5.0mmol／L，HEPES 6.0mmol／L，葡萄糖7.5mmol／L。生理鹽溶液中迅速取出BA和MA。所用藥物用生理鹽溶液配制，通過開關(guān)控制藥物灌流標(biāo)本，保持灌流速度、溫度和其他成分不變。所用藥物有：氟滅酸由Sigma公司提供，其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 微動脈段標(biāo)本制備 截取好的微動脈標(biāo)本置于直徑35mm的培養(yǎng)皿中，血管微動脈長約0.4mm，直徑在40～80 μm之間，兩端用細(xì)鉑金片固定在培養(yǎng)皿底部，在37℃溫箱中用含有膠原酶A（1.5mg／mL）的生理鹽溶液處理15min，生理鹽溶液置換2次去除殘存膠原酶A，體顯微鑷下進一步去除附在微動脈上的結(jié)締組織。

表1 微動脈段上和單個平滑肌細(xì)胞的膜電生理特性的比較

1.2.2 單個平滑肌細(xì)胞制備 將微動脈置于細(xì)胞分離液中20min，細(xì)胞分離液成分為：NaCl 142.00mmol／L，KCl 5.00 mmol／L，CaCl20.05mmol／L，MgCl21.00mmol／L，Na－HEPES 4.00mmol／L，HEPES 5.00mmol／L，葡萄糖 7.50 mmol／L。將微動脈剪成幾段放入消化液后，在37℃溫箱中消化20～25min，消化液成分包括：木瓜蛋白酶0.75mg／mL，膠原酶Ⅰ1.00mg／mL，牛血清清蛋白3.75mg／mL，二硫蘇糖醇0.30mg／mL。1 000r／min離心6min后棄上清液，加入細(xì)胞分離液制成細(xì)胞懸浮液，如此反復(fù)替換3次后，將液體移至用多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)皿內(nèi)，靜置30min使細(xì)胞貼壁。生理鹽溶液沖洗20min后進行全細(xì)胞膜片鉗實驗。

1.2.3 全細(xì)胞膜片鉗記錄 室溫條件下（22～25℃）標(biāo)本持續(xù)灌注生理鹽溶液（0.2mL／min）進行全細(xì)胞膜片鉗實驗。記錄電極阻抗約為5MΩ，P－97拉制儀拉制。電極內(nèi)液成分是：K－gluconate 130.0mmol／L，NaCl 10.0mmol／L，CaCl22.0 mmol／L，MgCl21.2mmol／L，HEPES 10.0mmol／L，EGTA 5.0mmol／L，葡萄糖7.5mmol／L。通過微操縱器接觸到細(xì)胞后給予負(fù)壓形成GΩ封接。補償電極電容后給予瞬時較強負(fù)壓或者電刺激擊破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞膜片鉗，膜電流用10 kHz（－3dB）低頻濾過［15］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 微動脈平滑肌細(xì)胞間的縫隙連接 微動脈段上和單個平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞膜電生理特性（表1），MA和BA微動脈段上平滑肌細(xì)胞Cinput大約是消化分離的單個平滑肌細(xì)胞的10倍，Ginput大約是單個平滑肌細(xì)胞的20倍。

圖1 氟滅酸對微動脈平滑肌細(xì)胞間縫隙連接的抑制作用

2.2 氟滅酸抑制微動脈平滑肌細(xì)胞間的縫隙連接 應(yīng)用氟滅酸前細(xì)胞膜電流幅度顯著大于應(yīng)用氟滅酸（300μmol／L）后（圖1），細(xì)胞Rinput從0.32GΩ增加到2.15GΩ。表2總結(jié)了氟滅酸對微動脈段平滑肌細(xì)胞Cinput、Rinput和Ginput的影響，應(yīng)用氟滅酸干預(yù)后記錄平滑肌細(xì)胞的Cinput、Rinput和Ginput與表1中單個細(xì)胞的數(shù)值十分接近。此外，應(yīng)用單指數(shù)方程分別對氟滅酸干預(yù)和對照組記錄平滑肌細(xì)胞膜電容充放電過程進行擬合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氟滅酸干預(yù)前擬合效果較差（r≤0.90），干預(yù)后擬合效果較好（r＞0.98），細(xì)胞Cinput的充放電的時間常數(shù)也由11.00ms減少至0.32ms。

表2 氟滅酸對微動脈段上平滑肌細(xì)胞膜電生理特性的影響

應(yīng)用斜坡電壓刺激顯示氟滅酸凈電流的電流／電壓（I／V）曲線呈線性（圖2），且微動脈段上記錄平滑肌細(xì)胞的靜息電位與翻轉(zhuǎn)電位點十分接近，提示氟滅酸主要抑制相鄰細(xì)胞間縫隙連接通道。

圖2 氟滅酸凈電流的I／V曲線

圖3 氟滅酸濃度依賴的抑制微動脈上平滑肌細(xì)胞膜電導(dǎo)

2.3 氟滅酸濃度依賴的抑制微動脈平滑肌細(xì)胞間縫隙連接氟滅酸可以濃度依賴性的抑制微動脈上平滑肌細(xì)胞間縫隙連接（圖3），氟滅酸（1～1 000μmol／L）能夠濃度依賴的減少微動脈段上平滑肌細(xì)胞的Ginput。經(jīng)繪制曲線發(fā)現(xiàn)氟滅酸抑制BA和MA細(xì)胞間縫隙連接通道的IC50分別為33和56μmol／L，氟滅酸抑制兩種微動脈細(xì)胞間縫隙連接通道的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

本實驗在BA和MA上通過以下3個方面得以證實氟滅酸可以可逆和濃度依賴的抑制細(xì)胞間縫隙連接通訊：（1）氟滅酸能夠增加微動脈段上平滑肌細(xì)胞的Rinput至單個平滑肌細(xì)胞水平；（2）氟滅酸可以減小微動脈段上平滑肌細(xì)胞Cinput值和Ginput值接近于單個細(xì)胞；（3）氟滅酸后能夠降低細(xì)胞膜充放電時間至單個細(xì)胞水平，且單指數(shù)方程能夠較好的擬合［16－17］。結(jié)果提示，當(dāng)氟滅酸的濃度≧300μmol／L時BA和MA微動脈段上平滑肌細(xì)胞間的縫隙連接通道可以被完全抑制。此外，氟滅酸對BA和MA兩種微動脈細(xì)胞間縫隙連接通道的抑制作用無統(tǒng)計學(xué)差異，提示相同的連接蛋白表達(dá)在上述兩種微動脈。

Harks等［18］報道在健康大鼠腎成纖維細(xì)胞和過表達(dá)Cx43的SKHep1細(xì)胞上氟滅酸可以阻斷細(xì)胞間的縫隙連接通訊，IC50是40μmol／L，當(dāng)濃度大于或等于250μmol／L時氟滅酸可以完全阻斷細(xì)胞間的縫隙連接通訊。此結(jié)果與本實驗的結(jié)果一致。血管微動脈主要表達(dá)Cx37、Cx40、Cx43和Cx45，其中平滑肌細(xì)胞上主要表達(dá)Cx37、Cx43和Cx45，內(nèi)皮細(xì)胞上主要表達(dá)Cx37、Cx40和Cx43［13］。本實驗結(jié)果提示，在 MA和BA微動脈上平滑肌細(xì)胞間縫隙連接通道可能是由Cx43和其他幾種連接蛋白組成的異聚體。另有文獻報道，在N2A神經(jīng)母細(xì)胞瘤上氟滅酸能夠非選擇性阻斷由Cx26、Cx32、Cx40、Cx43、Cx46和Cx50分別組成的縫隙連接通道［19］。

縫隙連接是相鄰細(xì)胞間的連接通道排列而組成的一種特殊膜結(jié)構(gòu)，能夠允許某些離子以及相對分子質(zhì)量小于1×103的分子自由通過，是細(xì)胞間進行物質(zhì)交換和信息通訊的途徑［20］?？p隙連接與血管緊張度的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，通過縫隙連接電化學(xué)信號的直接交流，使血管能夠保持電和機械活動的同步性，對刺激信息作出同步性的反應(yīng)，保證血管舒縮功能的一致和穩(wěn)定。病理情況下，傷害性信息也能夠相鄰細(xì)胞間存在的縫隙連接通道進入正常細(xì)胞，進而使正常細(xì)胞出現(xiàn)病理性改變［9］，如果提前應(yīng)該縫隙連接阻斷劑阻斷異常細(xì)胞與正常細(xì)胞間的縫隙連接通道，則傷害性信息不會傳遞至正常細(xì)胞。Saltman等［21］發(fā)現(xiàn)在心肌梗死的動物模型上提前應(yīng)用了縫隙連接阻斷劑庚醇，心肌梗死的面積顯著降低。因此，縫隙連接阻斷劑將會是治療心腦血管疾病非常重要的工具。

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