御糖丸對糖尿病大鼠心肌酶及過氧化物酶體增殖劑活化受體α mRNA表達的影響

劉 豐，楊云松，謝 寧

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040）

御糖丸對糖尿病大鼠心肌酶及過氧化物酶體增殖劑活化受體α mRNA表達的影響

劉 豐，楊云松，謝 寧

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040）

目的 研究中藥御糖丸對糖尿病大鼠心肌能量代謝酶、過氧化物酶體增殖劑活化受體α（PPARα）mRNA表達的影響，探討該藥物防治糖尿病心肌病發(fā)生的療效及可能機制。方法 采用SD大鼠腹腔注射STZ方法建立實驗動物模型，成模后將大鼠模型分為模型組、御糖丸高、中、低劑量組，造模后8周分別按實驗要求灌胃治療，正常對照組灌生理鹽水，連續(xù)4周。高效液相色譜法測定大鼠心肌組織肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）和琥珀酸脫氫酶（SDH）活性，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）測定心肌組織PPAR mRNA表達。結(jié)果

空白模型組大鼠心肌CK、LDH、SDH活性普遍降低，指標明顯低于正常對照組（P＜0.01），御糖丸各劑量組指標較空白模型組均有提升，但中劑量組和高劑量組提高顯著（P＜0.05）?？瞻啄Ｐ徒MPPAR mRNA表達水平顯著低于正常對照組（P＜0.01），御糖丸各劑量組PPARa mRNA表達水平均高于空白模型組（P＜0.05），但中高劑量組提高較為顯著（P＜0.01）。結(jié)論 中成藥御糖丸能夠提升糖尿病大鼠心肌酶CK，LDH，SDH的活性和上調(diào)PPARa mRNA表達水平，對改善心肌能量代謝和保護心肌組織具有良好作用。

糖尿病心肌病;御糖丸;能量代謝;大鼠

隨著人們生活水平的提高，人口老齡化以及肥胖的問題越來越突出，糖尿病發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。糖尿病是目前最常見的慢性病之一。糖尿病性心肌病是糖尿病的一種重要的并發(fā)癥。心肌物質(zhì)和能量代謝改變，是糖尿病心肌病發(fā)生的重要環(huán)節(jié)［1］，目前對其具體機制尚不完全清楚。近些年，中醫(yī)和中西醫(yī)結(jié)合治療該病的研究比較深入，取得了很多有價值的成果［2-3］。2004 年 VanBilsen等［4］提出心肌能量代謝重構(gòu)的概念，認為心肌細胞糖類和脂肪等物質(zhì)代謝紊亂引起心臟能量代謝途徑改變，從而導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能異常。我院采用益氣養(yǎng)陰法治療糖尿病心肌病，創(chuàng)制了中成藥御糖丸，臨床療效肯定。為了進一步探究其療效事實背后的科學(xué)機制，課題組借助實驗研究了糖尿病大鼠心肌細胞能量代謝的變化以及御糖丸對其產(chǎn)生的影響，從而探討中藥防治糖尿病心肌病發(fā)生的可能機制。報告如下。

1 材料

1.1 試劑 測定心肌組織肌酸激酶（CK）試劑盒，乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒，琥珀酸脫氫酶（SDH）試劑盒，均由南京建成生物工程研究所提供;測定心肌組織過氧化物酶體增殖劑活化受體（PPAR）mRNA表達的RT-PCR試劑盒（杭州博日科技有限公司提供），Trizol試劑（上海生工提供），DNA Marker（北京艾德萊生物科技有限公司提供）;6xRNAloadingbuffer上樣液（上海生工提供）。

1.2 儀器 3k15高速冷凍離心機（德國Sigma公司），T148050-900型 PCR儀（德國 Biometra公司），水平電泳儀（美國伯樂BIO-RAD公司），Dolphin Doc凝膠成像系統(tǒng)和Dolphin-ID軟件（美國Wealtec公司），21型分光光度計（上海第二分析分析儀器廠），高壓滅菌鍋（日本三洋公司），MP200A型電子天平（上海良平儀器廠），MDF-382E型超低溫冰箱（日本三洋公司），電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）。

1.3 動物 60只8周齡SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量150～210 g，由長春中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.4 制劑 御糖丸（由黑龍江省中西醫(yī)結(jié)合研究所制劑室生產(chǎn)）藥物組成:西洋參、黃芪、山藥、玉竹、龜板、白芍、麥冬、山茱萸、女貞子、烏梅、鹿茸、葛根等組成。水煎3次，每次煎煮30 min，將濾液蒸發(fā)為分別含生藥1.0，1.8，2.0 g/mL的低、中、高劑量湯劑。

2 方法

2.1 造模方法 將SD大鼠雌雄隨機各抽取5只，作為正常對照組，其余50只作為造模用，禁食（不禁水）2 h后，每只大鼠腹腔注射用0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液（pH為4.2）配制的0.55%STZ（55 mg/kg）完成造模［5］。1周后采用眼外眥取血，測空腹血糖，血糖高于13.8 mmol/L（250 mg/dL）為造模成功［6］。正常對照組腹腔內(nèi)相應(yīng)注射等體積枸櫞酸緩沖液，各組大鼠均喂以普通飼料（正常飲水）。

2.2 分組與處理 選取DM造模成功大鼠40只，隨機平均分入模型組、御糖丸高、中、低劑量組，各組大鼠分別給予灌胃治療，模型組用生理鹽水6.5 g/kg灌胃，低、中、高劑量組各按7，12.6，14 g/kg 灌胃，1 次/d，連續(xù)給藥4周。正常對照組10只大鼠不做任何處理。

2.3 指標檢測 樣本采集:冰上迅速解剖取其心室肌組織，4℃生理鹽水清洗，剪成小塊裝入凍存管中，先置液氮中，后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱中待測。

2.4 心肌酶活性測定 術(shù)后腹腔麻醉處死，迅速摘取心臟，用冷生理鹽水沖洗，切取左心室肌組織約100 mg，編號用冰生理鹽水制備成10%的勻漿，迅速離心，取上清液用相應(yīng)心肌酶測定試劑盒測定CK和LDH 活性［7-8］。

2.5 心肌組織PPAR mRNA表達測定 依據(jù)Gene Bank中大鼠的PPAR mRNA序列及β-ActinmRNA序列設(shè)計引物，經(jīng)blast進行特異性確定，最后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物。對心肌組織總RNA用Trizol試劑進行提取，提取后取5 μL RNA加入95 μL DEPC水中，經(jīng)紫外分光光度計A260/A280，比值大于或等于 1.80，以 A260計算RNA的濃度;同時取10 μL RNA進行Agarose凝膠電泳實驗，觀察28，18，5 s的完整性，結(jié)果說明RNA樣品純度理想，其余置－80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。接著進行RT逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、PCR擴增反應(yīng)，對RT-PCR產(chǎn)物進行鑒定及定量分析。

2.6統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，各組間比較采用t檢驗，采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 對糖尿病大鼠心肌CK，LDH，SDH活性的影響見表1。

表1 對糖尿病大鼠心肌CK，LDH，SDH活性的影響（±s，n=10）U/mgprot

表1 對糖尿病大鼠心肌CK，LDH，SDH活性的影響（±s，n=10）U/mgprot

注:與正常對照組比較，##P＜0.01;與空白模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 劑量/（g·kg）CK LDH SDH正常對照組 — 161.01±11.06 6 352.22±441.07 7.36±1.12空白模型組 — 87.23±15.28## 3 685.26±312.32## 2.34±1.07##御糖丸低劑量組 7 97.13±17.12△△ 4 156.41±428.27△ 2.56±1.16△御糖丸中劑量組 12.6 113.41±16.33△△ 5 077.34±399.21△ 5.94±1.09△御糖丸高劑量組 14 136.22±11.25△△ 5 286.63±441.35△ 6.12±1.17△

3.2 對糖尿病大鼠心肌PPARa mRNA相對表達量的影響 見表2。

表2 對糖尿病大鼠心肌PPARa mRNA相對表達量的影響（±s，n=10）

表2 對糖尿病大鼠心肌PPARa mRNA相對表達量的影響（±s，n=10）

注:與正常對照組比較，##P＜0.01;與空白模型組比較，△△P＜0.01

組 別 劑量/（g·kg） PPARa mRNA/β-action正常對照組 — 1.95±0.11空白模型組 — 1.15±0.10##御糖丸低劑量組 7 1.28±0.06△△御糖丸中劑量組 12.6 1.56±0.15△△御糖丸高劑量組 14 1.88±0.12△△

4 討論

中藥御糖丸的配方是根據(jù)健脾補腎、益氣養(yǎng)陰法的治療原則，結(jié)合現(xiàn)代藥理研究成果，精心選擇藥物組配成的方劑。方中西洋參作為君藥，歸心脾腎經(jīng)，能補氣養(yǎng)陰、清火生津。黃芪功擅補氣升陽，生津止渴。山藥為臣，味甘性平，主歸脾肺腎經(jīng)，能益氣養(yǎng)陰，補脾肺腎。山茱萸補精又助陽，為平補陰陽之品。玉竹味甘，歸肺胃經(jīng)，長于養(yǎng)陰潤燥，生津止渴，補養(yǎng)而不戀邪。麥冬味甘，養(yǎng)陰潤肺，益胃生津。葛根為佐使藥，性味甘辛而涼，入足太陰脾經(jīng)和足陽明胃經(jīng)，能主消渴。烏梅味酸澀性平，入肺脾大腸經(jīng)，有斂肺，澀腸，生津之功。白芍功效養(yǎng)血斂陰，柔肝止痛，平抑肝陽。女貞子甘苦性涼，歸肝腎經(jīng)，補中兼清，能滋養(yǎng)肝腎之陰。龜板甘咸寒，滋陰潛陽，養(yǎng)血補心。鹿茸甘咸溫，入肝腎經(jīng)，補腎陽，益精血，強筋骨。諸藥合用，共奏補腎益氣，滋陰生津，活血通絡(luò)之功。臨床及實驗研究證實，具有良好的降血糖作用。

從本研究的結(jié)果來看，空白模型組大鼠心肌CK、LDH、SDH活性普遍降低，指標顯著低于正常對照組（P＜0.01），御糖丸各劑量組指標較空白模型組均有升高，但中劑量組和高劑量組提升顯著（P＜0.05）?？瞻啄Ｐ徒MPPARmRNA表達水平顯著低于正常對照

組（P＜0.01），御糖丸各劑量組PPARamRNA表達水平均高于空白模型組（P＜0.05），但中高劑量組提高較為顯著（P＜0.01）。這一結(jié)果說明:1）糖尿病模型大鼠會出現(xiàn)心肌細胞能量代謝障礙;2）不同劑量的中藥御糖丸不僅具有降糖作用，還能較好地干預(yù)心肌能量代謝，但是，低劑量的作用效果不如中、高劑量;3）基于心肌酶變化的分析，可以認為中藥御糖丸能降低糖尿病大鼠模型的心肌損傷，其機制可能是減輕心肌細胞膜損傷，穩(wěn)定細胞膜，減少了CK，LDH，SDH等酶的漏出，糾正能量代謝障礙，增加心肌收縮和舒張能量的供應(yīng)和儲備，從而改善心肌功能，對防止糖尿病心肌病的發(fā)生具有重要意義;4）中藥御糖丸干預(yù)糖尿病心肌能量代謝的機制尚不明了，但從本研究結(jié)果分析，其作用機制可能與心肌PPARa調(diào)控有關(guān)，需要深入研究。

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［1］陳灝珠.實用內(nèi)科學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:1015-1062.

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［3］劉葦葦，陳惠，游焌，等.糖尿病心肌病的中西醫(yī)診療［J］.吉林中醫(yī)藥，2012，32（10）:998-1002.

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Effect of Yutang Pill on myocardial enzymes and PPARa mRNA expression of diabetic rats

LIU Feng，YANG Yunsong，XIE Ning
（Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

ObjectiveTo study the effect of Yutang Pill on myocardial energy metabolism enzyme agent and peroxidase proliferation activated receptorα （PPARα）mRNA expression of diabetic rats，and to discuss the curative effect and possible mechanism of the drug's prevention and treatment for diabetic cardiomyopathy.MethodsResearchers use STZ intraperitoneal injection for SD rats to establish the experimental animal models and then divide the rats into model group，yu-tang pill high dose group，Yutang Pill medium and low dose groups.8 weeks after the modeling，different lavage treatment，as required above，are applied to different groups for four weeks and control group use saline.High performance liquid chromatography is used to test creatine kinase（CK），lactate dehydrogenase（LDH），succinate dehydrogenase（SDH）activity and reverse transcriptase-polymerase chain reaction（RT-PCR）is used to test the expression of PPARα mRNA.ResultsMyocardial CK，LDH，SDH activity in blank model group are generally declined and the index is significantly lower than that of the normal control group（P ＜0.01）.For group with different dose of Yutang Pill，the index is higher than the blank model group，among which the medium and high group improved significantly（P ＜0.05）.PPARαmRNA expression level of blank model group is significantly lower than normal control group（P ＜0.01），and PPARαmRNA expression level of group with different dose of Yutang Pill are high-er than blank model group（P ＜0.05），among which the medium and high group improved significantly（P ＜0.01）.ConclusionYutang Pill can improve diabetic rats'myocardial enzyme CK，LDH and the activity of SDH and raised PPARαmRNA expression level，which is beneficial to improve myocardial energy metabolism and protect myocardial tissue.

diabetic cardiomyopathy;Yutang Pill;energy metabolism;rat

R285.5

A

2095－6258（2014）05－0787－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.05.010

黑龍江省政府博士后資助基金項目（LBH-Z09005）。

劉 豐（1972－），男，醫(yī)學(xué)博士，博士后在站，副主任醫(yī)師。研究方向:中西醫(yī)結(jié)合防治心血管病、代謝綜合征。

2014－05－07）