利用高通量測(cè)序技術(shù)分析核桃基因組微衛(wèi)星特征1)

廖卓毅 馬秋月 戴曉港 張得芳 李淑嫻

(林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南京林業(yè)大學(xué))，南京，210037)

微衛(wèi)星序列(microsatellite or simple sequence repeats，SSR)是指以1～6個(gè)核苷酸為基本重復(fù)單位的串聯(lián)重復(fù)序列[1]。微衛(wèi)星廣泛分布于各種生物的基因組中，尤其是真核生物基因組中。在群體間和不同個(gè)體間，微衛(wèi)星序列均表現(xiàn)出很高的變異性，其在基因組中的位置決定了它的功能，能夠影響包括基因調(diào)控、發(fā)展和進(jìn)化等各個(gè)方面。目前，SSR分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析、連鎖圖譜制作、疾病連鎖分析和品種鑒定等方面[2－4]。

目前，微衛(wèi)星在遺傳學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，隨著大規(guī)模物種基因組測(cè)序工作的開(kāi)展，已經(jīng)在脊椎和無(wú)脊椎動(dòng)物(人類、蚊子、雞、斑馬魚(yú)和中國(guó)對(duì)蝦等)、植物(擬南芥、水稻和小麥等)以及一些原核生物等30個(gè)以上的物種進(jìn)行了基因組微衛(wèi)星分布特征分析[5－9]。這些研究結(jié)果表明，不同物種微衛(wèi)星的分布特征存在著較大差異，微衛(wèi)星的突變率也不相同[10－11]，并且物種本身堿基組成也是選擇的結(jié)果。所以基于物種間基因組水平上微衛(wèi)星分布特征的比較分析，有助于從進(jìn)化學(xué)的角度了解各重復(fù)類型分布特點(diǎn)及其功能。

核桃(Juglans regia L.)又名胡桃、合桃，屬于胡桃科核桃屬[12]，果實(shí)富含碳水化合物、油脂、維生素和礦物質(zhì)，享有“長(zhǎng)壽之果”的美譽(yù)，是理想的滋補(bǔ)食品。不同學(xué)者對(duì)核桃微衛(wèi)星已有了一定的研究，Woeste等[13]最早通過(guò)構(gòu)建微衛(wèi)星文庫(kù)，從黑核桃中開(kāi)發(fā)出30對(duì)SSR引物用于品種的鑒別;齊建勛等[14]通過(guò)檢索核桃EST序列，開(kāi)發(fā)了40對(duì)EST－SSR引物。Dangl等[15]應(yīng)用SSR標(biāo)記對(duì)主要來(lái)自歐美的48份資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析和品種的SSR鑒定。Wang等[16]用8個(gè)SSR標(biāo)記研究了核桃和鐵核桃天然居群的遺傳結(jié)構(gòu)。劉秀麗等[17]用7個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)3個(gè)核桃群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，但從基因組水平上對(duì)核桃微衛(wèi)星進(jìn)行分析還沒(méi)有報(bào)道。本研究利用Roche—454GSFLX高通量測(cè)序平臺(tái)，對(duì)核桃進(jìn)行低覆蓋度的基因組測(cè)序，并分析其微衛(wèi)星序列組成及特征、微衛(wèi)星分布頻率和豐度，旨在為從基因組水平上了解核桃微衛(wèi)星進(jìn)化和功能以及微衛(wèi)星標(biāo)記的開(kāi)發(fā)、品種的真實(shí)性鑒定研究等工作提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料取自南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。2012年春天采集剛萌發(fā)的嫩葉，采集后立即置于便攜式冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，置于冰箱中－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1 DNA提取及測(cè)序

基因組DNA的提取和提純采用植物DNA提取試劑盒DP305(上海玉博生物科技有限公司)。利用Roche－454GS FLX測(cè)序儀對(duì)核桃DNA樣品進(jìn)行測(cè)序。

1.2 分析方法

測(cè)序后所得數(shù)據(jù)利用454自帶軟件Roche Newbler 2.7進(jìn)行序列拼接。采用 Misa(www.pgrc.ipkgatersleben.de/misa)程序進(jìn)行所有重復(fù)單元長(zhǎng)度微衛(wèi)星的查找，其中參數(shù)設(shè)置為:單堿基重復(fù)最短為10個(gè)重復(fù)、二堿基重復(fù)最短為6個(gè)重復(fù)、三堿基重復(fù)最短為4個(gè)重復(fù)、四堿基重復(fù)最短為3個(gè)重復(fù)、五堿基重復(fù)最短為3個(gè)重復(fù)、六堿基重復(fù)最短為2個(gè)重復(fù)。不同重復(fù)單元微衛(wèi)星密度的計(jì)算:D=N/L。其中，D為不同重復(fù)微衛(wèi)星密度(個(gè)/Mb);N為各重復(fù)單元微衛(wèi)星數(shù)量(個(gè));L為核桃基因組重疊群總長(zhǎng)(Mb)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序及拼接結(jié)果

本研究利用Roche－454 FLX高通量測(cè)序后，共測(cè)得104.5 Mb的核桃基因組序列，序列總數(shù)為541176條，堿基總數(shù)為194024314 bp，平均讀長(zhǎng)為358.5 bp。在所測(cè)得的序列中，CG堿基數(shù)為72563561 bp，CG堿基比例為37.41%。此外 Q20占總堿基百分比為85.5%。在高通量測(cè)序中，每測(cè)一個(gè)堿基就會(huì)給出一個(gè)相應(yīng)的質(zhì)量值，用以衡量測(cè)序的準(zhǔn)確度，堿基的質(zhì)量值為20，表示測(cè)序的錯(cuò)誤率為1%，所以Q20含量是評(píng)價(jià)測(cè)序準(zhǔn)確率的有效指標(biāo)。本試驗(yàn)中Q20所占總堿基百分比為85.5%，表明測(cè)序具有較高的準(zhǔn)確度。

通過(guò)Roche Newbler 2.7軟件進(jìn)行序列拼接和組裝，產(chǎn)生了143078個(gè)完全組裝序列，68799個(gè)部分組裝序列，320318個(gè)單一序列以及1622個(gè)重復(fù)序列。其中大于500 bp的重疊群有9707個(gè)，重疊群的最大長(zhǎng)度為47928 bp，部分拼接數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 有效讀長(zhǎng)序列拼接結(jié)果

對(duì)核桃基因組進(jìn)行測(cè)序查找，共獲得SSR序列9787條，核桃基因組部分微衛(wèi)星重復(fù)序列的信息見(jiàn)表2。

2.2 核桃基因組微衛(wèi)星豐度及分布密度分析

通過(guò)對(duì)核桃基因組進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序，從總長(zhǎng)為9483541 bp的有效讀長(zhǎng)中找到9787個(gè)微衛(wèi)星，平均每969 bp出現(xiàn)一個(gè)。對(duì)獲得的SSR進(jìn)行密度分析，因各重復(fù)類型的長(zhǎng)度不一，所得密度也存在較大差異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在9787個(gè)核桃微衛(wèi)星中，六堿基重復(fù)為最多重復(fù)類型，共5883個(gè)，占總數(shù)的60.11%;其次是單堿基重復(fù)，1289個(gè)，占總數(shù)的13.17%;再次分別是四堿基重復(fù)、二堿基重復(fù)、三堿基重復(fù)和五堿基重復(fù)(表3)。

2.3 核桃基因組微衛(wèi)星的優(yōu)勢(shì)重復(fù)拷貝類型堿基組成分析

在單堿基重復(fù)中，A/T堿基為優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元，共1268個(gè)，占單堿基重復(fù)序列總數(shù)的98.37%，C/G堿基重復(fù)占1.63%;二堿基中，重復(fù)單元最多的為AT/TA，共399個(gè)，占二堿基重復(fù)序列總數(shù)的51.95%，其次是AG/CT和AC/GT，分別為278個(gè)(36.20%)和88 個(gè)(11.46%)，最少的 CG/GC，僅3 個(gè)，占總數(shù)的0.39%;在三堿基重復(fù)中，共發(fā)現(xiàn)9種重復(fù)單元，共計(jì)549個(gè)，其中AAT/ATT重復(fù)為181個(gè)，AAG/CTT重復(fù)151個(gè)，ATC/ATG重復(fù)72個(gè)，分別占三堿基重復(fù)序列總數(shù)的32.97%、27.50%和13.11%，三者共占總數(shù)的73.58%，其次是AGG/CCT重復(fù)為37個(gè)(6.74%)、ACC/GGT 重復(fù) 34 個(gè)(6.19%)、AAC/GTT重復(fù) 33個(gè)(6.01%)、ACT/AGT重復(fù) 21個(gè)(3.83%)、AGC/CTG 重復(fù) 16 個(gè)(2.91%)，最少的為ACG/CGT重復(fù)，僅4個(gè)，占0.73%;在889個(gè)四堿基重復(fù)中，AAAT/ATTT最多，共293個(gè)，占四堿基重復(fù)總數(shù)的32.96%，其次是AAAG/CTTT，共106個(gè)，占總數(shù)的11.92%，另外AATG/ATTC重復(fù)57個(gè)(6.41%)，AATT/AATT 重復(fù) 49 個(gè) (5.51%)，AAAC/GTTT重復(fù) 47個(gè)(5.28%)，ACAT/ATGT 重復(fù)、ATGC/ATGC重復(fù)和AGCT/AGCT重復(fù)均為41個(gè)(4.61%)，AGGG/CCCT 重復(fù)、AAGG/CCTT 重復(fù)和AATC/ATTG重復(fù)分別為26個(gè)(2.92%)、25個(gè)(2.81%)和24 個(gè)(2.70%);在五堿基重復(fù)中，總共25種重復(fù)類型，其中 AGATG/ATCTC重復(fù)和AAAAT/ATTTT重復(fù)為最多重復(fù)單元，分別為79個(gè)(19.31%)和 77 個(gè)(18.82%)，其次是 AAAAG/CTTTT，為37 個(gè)(9.05%)，另外，AAATG/ATTTC 重復(fù)18個(gè)(4.16%)、AAAAC/GTTTT重復(fù)17個(gè)(4.16%)、AATAT/ATATT 重復(fù)17個(gè)(4.16%)、ACCGG/CCGGT重復(fù)17個(gè)(4.16%)、ATATC/ATATG

重復(fù)14個(gè)(3.42%)、AACTC/AGTTG重復(fù)13個(gè)(3.41%)、AACAT/ATGTT 重復(fù)和 ACCCG/CGGGT重復(fù)均為11個(gè)(2.69%)，剩余其他重復(fù)單元較少;在5883個(gè)六堿基重復(fù)微衛(wèi)星中，重復(fù)單元類型多達(dá)118種，各重復(fù)單元所占總數(shù)的比例都很小，其中以AAAAAT/ATTTTT重復(fù)和AAAAAG/CTTTTT重復(fù)最多，分別為390個(gè)和299個(gè)，占總數(shù)的6.63%和5.08%，其它幾種含量較多的六堿基重復(fù)拷貝類型中，AAAAAC/GTTTTT重復(fù)(145個(gè))、AAAATT/AATTTT重復(fù)(129個(gè))、AAAATC/ATTTTG重復(fù)(114個(gè))、AAATAT/ATATTT重復(fù)(114個(gè))、AAAGAG/CTCTTT重復(fù)(101個(gè))、AAGAGG/CCTCTT重復(fù)(94個(gè))、AAATTG/AATTTC重復(fù)(93個(gè))、AAAAGG/CCTTTT重復(fù)(80個(gè))依次減小。

總體而言，在核桃基因組微衛(wèi)星序列中，六堿基重復(fù)是最豐富的微衛(wèi)星類型，其次是單堿基重復(fù)。對(duì)這6種微衛(wèi)星重復(fù)類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，我們還發(fā)現(xiàn)，五堿基重復(fù)微衛(wèi)星中AGATG和AAAAT是最多的兩類，而單堿基重復(fù)微衛(wèi)星中，A/T占總數(shù)的98.37%;同樣，二、三、四和六堿基重復(fù)微衛(wèi)星中，含量最多的分別是AN、AAN、AAAN和AAAAAN(N表示除A堿基外的其他任何堿基)。總的來(lái)說(shuō)，核桃微衛(wèi)星中富含A和T堿基。

表2 核桃微衛(wèi)星數(shù)據(jù)庫(kù)的部分結(jié)果

表3 不同長(zhǎng)度重復(fù)單元微衛(wèi)星所占比例及分布密度

2.4 核桃基因組微衛(wèi)星長(zhǎng)度分布及變異分析

本研究中核桃基因組微衛(wèi)星的平均長(zhǎng)度為21.86 bp，最長(zhǎng)578 bp，最短10 bp，這些微衛(wèi)星以10 ～20 bp 為主，長(zhǎng)度≥20 bp的微衛(wèi)星僅占17.22%(圖1)。

圖1 核桃微衛(wèi)星長(zhǎng)度分布及不同長(zhǎng)度微衛(wèi)星頻率

進(jìn)一步對(duì)SSR相對(duì)豐度與重復(fù)次數(shù)的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明，核桃中SSR相對(duì)豐度隨著重復(fù)次數(shù)的增加而迅速下降，但不同基因序列長(zhǎng)度類型的下降速度不同。總體看，單堿基重復(fù)次數(shù)超過(guò)17、二堿基超過(guò)19、三堿基超過(guò)8、四堿基和五堿基超過(guò)6、六堿基超過(guò)4之后，相對(duì)豐度就接近于零了。從柱狀數(shù)量變化還可以看出，二堿基重復(fù)微衛(wèi)星長(zhǎng)度的變化次數(shù)明顯多于其它重復(fù)類型。在這些重復(fù)類型中，六堿基重復(fù)微衛(wèi)星長(zhǎng)度的變化次數(shù)最少，這表明二堿基重復(fù)微衛(wèi)星的變異程度最高，六堿基重復(fù)的變異程度最低(表4)。

表4 6種重復(fù)類型中長(zhǎng)度變異情況

3 結(jié)論與討論

在核桃總長(zhǎng)為948354 bp的有效讀長(zhǎng)中有9787個(gè)微衛(wèi)星，平均每969 bp出現(xiàn)1個(gè)微衛(wèi)星，分布密度為1032個(gè)/Mb。在已見(jiàn)報(bào)道的一些植物微衛(wèi)星密度中，油茶微衛(wèi)星密度為539.5個(gè)/Mb，楊樹(shù)基因組序列平均1883 bp出現(xiàn)1個(gè)微衛(wèi)星，分布密度為531.1個(gè)/Mb，均低于核桃微衛(wèi)星的分布密度。鄭燕[18]等對(duì)水稻、玉米、高粱和二穗短柄草4種禾本科植物SSR的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，不同植物的基因組中，SSR的積累速度及進(jìn)化速度可能會(huì)有所不同，基因組中SSR數(shù)量與物種基因組大小有關(guān)，通過(guò)與其他植物已測(cè)定基因組序列的對(duì)比，可以為核桃基因組的測(cè)序工作提供有益幫助。

目前大多數(shù)木本植物微衛(wèi)星的分析研究主要局限于少數(shù)微衛(wèi)星位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)分析[19]，而大量微衛(wèi)星的生物信息學(xué)分析卻僅限于極少數(shù)幾個(gè)樹(shù)種，已完成整個(gè)基因組SSR測(cè)序的楊樹(shù)是為數(shù)不多的物種之一[20]。通過(guò)與楊樹(shù)微衛(wèi)星密度的對(duì)比，可以為核桃整個(gè)基因組微衛(wèi)星測(cè)序工作提供參考。本試驗(yàn)對(duì)核桃基因組微衛(wèi)星進(jìn)行了低覆蓋度的測(cè)序，結(jié)果表明，在核桃基因組微衛(wèi)星序列中，六核苷酸重復(fù)的比例在所有重復(fù)類型中最多，占60.11%。目前已完成測(cè)序的微衛(wèi)星生物信息學(xué)分析表明，玉米[16]、高粱[6]和楊樹(shù)[20]主要以三核苷酸重復(fù)為優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型;有的生物，如人、擬南芥和秀麗隱桿線蟲(chóng)則以單核苷酸重復(fù)為最優(yōu)[6，21];有些生物，如果蠅、家蠶等以二核苷酸重復(fù)為主[6－8]，而六核苷酸重復(fù)占優(yōu)的現(xiàn)象則極為罕見(jiàn)。筆者認(rèn)為可能是由于本試驗(yàn)只對(duì)核桃基因組微衛(wèi)星序列進(jìn)行了低覆蓋度的測(cè)序，獲得的結(jié)果不夠全面所致，但確切的原因還有待進(jìn)一步研究。已發(fā)表物種微衛(wèi)星序列特征的報(bào)道中，對(duì)于六核苷酸重復(fù)在生物中作用的研究還比較少，所以六核苷酸重復(fù)占優(yōu)勢(shì)對(duì)核桃遺傳學(xué)上的影響將是一個(gè)新的研究領(lǐng)域。

對(duì)核桃基因組微衛(wèi)星進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)核桃基因組微衛(wèi)星中富含A和T堿基，而C和G的含量很少，但隨著重復(fù)單元長(zhǎng)度的增加，C和G的含量也在增加。在單堿基重復(fù)中，A/T含量高達(dá)98.37%，二核苷酸重復(fù)中，A/T含量占51.95%，這與人、有胚植物、酵母和真菌類生物基因組微衛(wèi)星的分析結(jié)果類似[18]。隨著堿基長(zhǎng)度的增加，C和G堿基可以增加堿基重復(fù)的穩(wěn)定性[22]，而微衛(wèi)星中富含A和T堿基，使得Tm值大大降低，DNA鏈容易解開(kāi)，通過(guò)DNA復(fù)制滑動(dòng)機(jī)制和重組機(jī)制，產(chǎn)生富含AT重復(fù)類型的機(jī)率更高。

本次還對(duì)核桃基因組不同單元類型微衛(wèi)星的長(zhǎng)度變異情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)這些微衛(wèi)星的長(zhǎng)度變異與所含重復(fù)單元的長(zhǎng)度成反比，除單核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星外，這些微衛(wèi)星的長(zhǎng)度變異程度隨著重復(fù)單元長(zhǎng)度的增加而降低。Samadi等[23]的模擬分析研究認(rèn)為重復(fù)單位長(zhǎng)度越長(zhǎng)，經(jīng)受的選擇壓力越大，因此它們的拷貝數(shù)就越少，長(zhǎng)度變異越低。由于序列長(zhǎng)度的分化情況反映了不同類型微衛(wèi)星序列獲得或失去重復(fù)單元的速率，所以這一特征與微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性關(guān)系密切，這反映了由短重復(fù)單元構(gòu)成的微衛(wèi)星失去或獲得重復(fù)單元的速率比長(zhǎng)重復(fù)單元構(gòu)成的微衛(wèi)星要快。閻毛毛等[24]在對(duì)楊樹(shù)、桉樹(shù)和松樹(shù)這3個(gè)樹(shù)種的SSR對(duì)比之后，得出了同樣的結(jié)果。這是否是林木表達(dá)序列所含微衛(wèi)星的共同的變化規(guī)律?這一假設(shè)還需要在更多的樹(shù)種中展開(kāi)分析加以驗(yàn)證。Temnykh等[25]將按長(zhǎng)度將微衛(wèi)星分為兩大類:長(zhǎng)度大于等于20 bp的SSR為第一類，長(zhǎng)度大于12 bp但小于20 bp的為第二類。本試驗(yàn)對(duì)9787個(gè)微衛(wèi)星的長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星長(zhǎng)度從10 bp到578 bp不等，微衛(wèi)星的平均長(zhǎng)度為21.86 bp，不同長(zhǎng)度的微衛(wèi)星的數(shù)量差異極顯著，且不符合正態(tài)分布，微衛(wèi)星主要第一類為主，第二類僅為17.22%。與第二類SSR相比，第一類SSR具有更高的多態(tài)性。這一規(guī)律是 Weber[26]最早于人類的微衛(wèi)星實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，并已在很多生物體中得到證實(shí)。第二類SSR由于片段長(zhǎng)度較短，在滑鏈錯(cuò)配時(shí)可產(chǎn)生的錯(cuò)配位點(diǎn)就會(huì)相對(duì)較少，故多態(tài)性不如第一類，由于較長(zhǎng)的微衛(wèi)星具有更高的變異頻率，因此會(huì)受到更強(qiáng)烈選擇的影響，這對(duì)于研究核桃基因組的起源時(shí)間具有重要的意義，其多態(tài)性也為核桃微衛(wèi)星位點(diǎn)的標(biāo)記提供了可行性。

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