剛毛檉柳光捕獲葉綠素a/b結合蛋白基因Thcab1的克隆與分析1)

劉亞麗

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

張凱敏 高彩球

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學))

光捕獲葉綠素a/b結合蛋白(LHCb)是光系統(tǒng)II(PSII)捕光復合物的脫輔基蛋白，通常與葉綠素和葉黃素形成捕光色素蛋白復合體[1]。作為捕光復合物的重要組成部分，PSII的外天線蛋白LHCBs是葉綠體類囊體中含量最豐富的膜蛋白，行使光能傳遞、轉化和分配等功能，在植物光合作用中起到關鍵的作用。目前，已從多種植物中克隆獲得了LHCB 蛋白基因，如擬南芥[2]、水稻[3]、龍舌蘭[4]、菠菜[5]、甘蔗[6]等。研究表明 LHCB 基因的表達受多種逆境脅迫的調控，包括氧脅迫[7]、鹽脅迫[8]和激素信號 ABA[7]等。

檉柳屬植物是一類多年生灌木或小喬木，非?？购的望}堿。研究發(fā)現(xiàn)低質量濃度(4 g/L)鹽水處理能促進多枝檉柳的生長和光合作用，只有在高質量濃度(12～28 g/L)的鹽水處理后，產生鹽分脅迫，使其因氣孔因素限制而光合作用下降[9]。目前，關于逆境脅迫后檉柳的生理及光合變化研究比較多，但是關于其分子機制的研究比較少。對剛毛檉柳根部[10]和葉部[11]組織鹽脅迫不同時間點的表達序列標簽(EST)，分析結果表明剛毛檉柳耐鹽分子機制非常復雜，對鹽堿脅迫的響應涉及多個生理和代謝途徑。其中一些光合相關基因也參與了檉柳的抗鹽脅迫，受鹽堿脅迫的誘導或抑制。本研究通過對0.3 mol/L NaHCO3脅迫處理0、12、24和48 h的剛毛檉柳根部組織和脅迫0、12、24 h葉部組織共7個轉錄組的序列進行分析，查找獲得了一條葉綠素a/b結合蛋白基因的全長cDNA序列，進一步對其在鹽脅迫處理后不同時間點的表達模式進行分析。旨在為進一步了解該基因在剛毛檉柳應答鹽脅迫中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 剛毛檉柳的培養(yǎng)和脅迫處理

將剛毛檉柳種子播種于V(泥炭土)∶V(沙)=2∶1的混合土壤中，培養(yǎng)在平均溫度24℃、光照時間14 h/d、相對濕度70% ～75%溫室中。待生長2個月后，進行脅迫處理。

用于轉錄組cDNA文庫構建的剛毛檉柳，采用0.3 mol/L NaHCO3溶液澆灌，分別在脅迫處理0、12、24和48 h后，取剛毛檉柳的葉部(地上部分)和根部(地下部分)組織用于剛毛檉柳轉錄組cDNA文庫的構建。

用于實時熒光定量RT－PCR分析的剛毛檉柳，分別澆灌水(對照)和0.4 mol/L NaCl溶液，于處理不同時間后收集剛毛檉柳的根部(地下部分)和葉部組織(地上部分)。NaCl處理的時間點包括3、6、9、12 和24 h 及 6 d 和 12 d，此外進行了 NaCl溶液澆灌6 d后，再復水6 d處理(標記為6 d+6 d)。每個樣品至少包括20棵苗木，每個處理重復3次。

1.2 Thcab1基因的克隆與序列分析

對剛毛檉柳7個轉錄組的Unigenes進行BLASTX和BLASTN分析，根據功能注釋結果查找獲得 Thcab1基因，用 ORF founder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.html)程序確定其開放讀碼框。用 ProtParam(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)軟件計算推導的ThCabl蛋白質的分子量及理論等電點;利用 Target P1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)預測蛋白亞細胞器定位;利用 BlastP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行序列同源性搜索;利用Clustal X1.83軟件對9種不同植物來源的cab1蛋白序列進行多序列比對，并繪制分子進化樹。

1.3 實時熒光定量RT－PCR

CTAB法提取對照(非脅迫處理)和0.4 mol/L NaCl處理不同時間點的剛毛檉柳根和葉部組織的總RNA，經DNase I(Promega)消化除去DNA，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)合成 cDNA。將合成后的第一鏈的cDNA稀釋10倍用于定量RTPCR分析。

實時定量RT－PCR使用試劑盒SYBR Green Realtime PCR Master mix(Toyobo)。內參基因為alpha tublin(genebank NO.FJ618518)、Actin(genebank NO.FJ618517)和 beta tublin(genebank NO.FJ618519)，引物序列見表1。實時定量 RT－PCR反應體系為:10 μL 2 ×SYBR premix Ex Taq酶、上下游引物(20 μmol/L)各 0.5 μL、2 μL 稀釋后的模板cDNA，加去離子水補足20 μL。qRT－PCR反應條件為:94℃預變性30 s;94℃變性15 s，61℃退火45 s，72 ℃ 延伸45 s;80.5 ℃ 讀板1 s，45 個循環(huán)。每個樣品重復3次，用2－△△Ct方法進行基因的相對定量分析[12]。

表1 實時定量RT－PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 Thcab1基因全長cDNA的獲得及序列分析

通過對剛毛檉柳7個轉錄組序列的查找和分析，獲得了Thcab1基因的全長cDNA序列。對Thcab1基因序列的ORF founder分析證實該基因的開放閱讀框(ORF)長822 bp，編碼273個氨基酸。5’非翻譯區(qū)(UTR)137 bp，3’非翻譯區(qū)(UTR)334 bp(圖1)。

ProtParam預測該基因編碼蛋白質的分子量為29.44 ku，理論等電點為 7.84。TargetP 預測表明該基因編碼的蛋白定位于葉綠體(圖2)。BLASTP對Thcab1蛋白保守區(qū)的預測結果表明該蛋白屬于光捕獲葉綠素a/b結合蛋白(圖3)。

通過BLASTP多序列比對，選擇與剛毛檉柳Thcab1蛋白序列相似程度高的8種其它植物的cab1蛋白進行多序列比對，這8種植物分別為木本植物梔子(Gardenia jasminoides)、毛果楊(Populus trichocarpa)和歐洲赤松(Pinus sylvestris);木質藤本植物葡萄(Vitis vinifera)和草本植物番茄(Solanum lycopersicum)、忽地笑(Lycoris aurea)、大豆(Glycine max)和黃瓜(Cucumis sativus)。多序列比對結果表明:Thcab1蛋白與其它植物cab蛋白的氨基酸序列一致性在78%～88%，其中番茄和毛果楊最高為88%。進化分析表明剛毛檉柳的Thcabl蛋白與番茄的進化關系比較近(圖4)。

2.2 Thcab1基因表達模式分析

通過對NaHCO3脅迫后的剛毛檉柳7個轉錄組數據分析發(fā)現(xiàn)，無論根還是葉中，Thcab1基因的表達都表現(xiàn)為明顯受鹽脅迫抑制(表2)。表明Thcab1基因可能參與了剛毛檉柳的抗逆脅迫響應;同時，在非脅迫情況下，葉中的Thcab1基因的表達量是根中表達量的88.2倍，鹽脅迫24 h后，葉中的Thcab1基因的表達量是根中的172.3倍，表明Thcab1基因主要在葉中表達。為了進一步分析Thcab1基因的鹽脅迫不同時間的應答情況，采用實時熒光定量RTPCR技術比較了鹽(0.4 mol/L NaCl)處理后8個不同時間點剛毛檉柳Thcab1基因的表達模式(表3)。結果表明，在0.4 mol/L NaCl脅迫下，Thcab1基因無論在根還是葉中，都表現(xiàn)為短時間內(24 h)受鹽脅迫的調控，而長時間表達量變化不大。脅迫后24 h內，在根中主要表現(xiàn)為上調表達，脅迫12 h表達量達到最高，被誘導了75.6倍。在葉中脅迫24 h表達量達到最大，表達量是非脅迫處理的35.3倍。

圖1 剛毛檉柳Thcab1基因的cDNA及由此推導的氨基酸序列

圖2 TargetP預測結果

圖3 剛毛檉柳Thcab1蛋白保守區(qū)預測

圖4 9種植物cab蛋白的多序列比對和系統(tǒng)進化分析

3 結論與討論

LHCB基因表達的調控被認為是植物調節(jié)葉綠體功能的重要機制之一[13]。先前的研究表明LHCB家族成員在植物適應環(huán)境脅迫中起重要作用[14]，其表達受 ABA 信號調控[7]。耐鹽植物海蓬子在0.2 mol/L NaCl處理后，類囊體膜上PSⅡ天線色素CP29蛋白和CP47蛋白以及位于PSⅡ和PSⅠ光捕獲系統(tǒng)上葉綠素a/b結合蛋白的表達明顯上調[8]。

本研究中，通過對剛毛檉柳鹽堿脅迫后的轉錄組數據查找分析，克隆獲得一個LHCB基因，保守區(qū)預測和蛋白定位分析都表明該基因符合光捕獲葉綠素a/b結合蛋白特征。與其它植物LHCB基因的氨基酸序列比對結果表明這些植物的LHCB基因氨基酸序列一致性高達78%～88%。轉錄組數據分析表明該基因的表達受鹽堿脅迫的抑制。定量數據表明高鹽(0.4 mol/L NaCl)脅迫后，在脅迫初期剛毛檉柳Thcab1基因的表達量受明顯的誘導，而隨著脅迫時間的延長，該基因的表達量與非脅迫處理間差異不明顯。張麗麗等[15]研究也表明，在耐鹽雜草稻(Oryza sativa L.f.spontanea)中，鋅指蛋白基因WR03－12中受鹽脅迫短時間誘導，長時間(第7天)恢復到脅迫前水平，表明這些基因可能主要參與鹽脅迫初期的應答。

表3 NaCl脅迫后Thcab1基因表達模式分析

在以往對剛毛檉柳的基因表達分析也表明NaCl和NaHCO3脅迫后基因的表達趨勢并不完全一致[11，16]。兩種脅迫后 Thcab1基因表達趨勢完全相反可能是由于堿性鹽(NaHCO3)對植物的影響不僅是產生鹽害(Na+)，同時由于其具有較高的pH值，高pH值強烈地影響了剛毛檉柳光合相關基因的表達。這表明Thcab1基因能對鹽和鹽堿脅迫做出應答，可能參與了剛毛檉柳的耐鹽、堿過程，但Thcab1基因在剛毛檉柳耐鹽、堿反應中的具體功能差異及調控機制等需要進一步研究。

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