腫瘤壞死因子α及其基因238G>A和863C>A多態(tài)性與廣西壯族原發(fā)性高血壓的相關(guān)性研究

趙艷英　黃照河　潘興壽　李天資　梁燁

【摘要】目的探討腫瘤壞死因子α（TNFα）基因238G>A和863C>A多態(tài)性與廣西壯族原發(fā)性高血壓（EH）的相關(guān)性。方法采用ELISA法檢測(cè)152例廣西壯族EH患者（EH組）和50例廣西壯族健康者（對(duì)照組）血清TNFα、血脂、血糖（FBG）水平，用PCRSBT（PCR Sequencing Based Typing）方法檢測(cè)TNFα基因238G>A和863C>A多態(tài)性，探討血壓、血脂、FBG、TNFα水平與TNFα基因238G>A和863C>A的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果EH組收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、FBG、TNFα、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、體重指數(shù)（BMI）與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005或0.01 ）；與對(duì)照組比較，EH組TNFα863C>A GG基因型和等位基因頻率更高（P<0.05或0.01），TNFα238G>A AA基因型和等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。結(jié)論 廣西壯族原發(fā)性高血壓患者血清TNFα水平增高可能與TNFα238G>A有關(guān)聯(lián)，與863C>A基因多態(tài)性無(wú)明確關(guān)聯(lián)。

【關(guān)鍵詞】原發(fā)性高血壓； 腫瘤壞死因子α；基因多態(tài)性

中圖分類號(hào)：R544.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2014.04.001

原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）是導(dǎo)致腦卒中、冠心病、心功能不全、腎臟疾病等重要疾病的主要危險(xiǎn)因素之一[1]，近年來(lái)的研究表明，EH患者的患病率和病死率有逐年增高趨勢(shì)[2]。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心（CDC）的橫斷面研究表明[3]，2010年我國(guó)成年人高血壓患病率為33.5%，估計(jì)患病人數(shù)為3.3億，每年有45萬(wàn)人死于高血壓。EH的發(fā)病機(jī)制還在探索之中，目前認(rèn)為遺傳和環(huán)境因素的交互作用與EH的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[4]。研究表明，腫瘤壞死因子α（TNFα）基因啟動(dòng)區(qū)基因多態(tài)性與TNFα的轉(zhuǎn)錄和分泌相關(guān)[5～9]，為了解TNFα基因多態(tài)性與EH的關(guān)聯(lián)性，本文探討TNFα238G>A及TNFα863C>A多態(tài)性與廣西壯族EH的相關(guān)性。1對(duì)象與方法1.1研究對(duì)象EH組選擇雙親均為壯族的原發(fā)性高血壓患者152例（樣本來(lái)源于廣西百色地區(qū)）作為觀察對(duì)象，均簽署知情同意書(shū)，其中男93例，女59例，平均年齡為（55.9±13.7）歲。中國(guó)高血壓防治指南（2010年修訂本）診斷標(biāo)準(zhǔn)，EH為：收縮壓（SBP）≥140 mmHg和/或舒張壓（DBP）≥90 mmHg；或者既往有高血壓史，正在服用降壓藥者，雖血壓<140/90 mmHg，也可入選。排除繼發(fā)性高血壓、糖尿病、冠心病、自身免疫性疾病、腦梗死、心力衰竭、泌尿系統(tǒng)疾病、感染性疾病、腫瘤、嚴(yán)重的肝腎功能不全及應(yīng)用抗炎藥物、免疫抑制劑，不能耐受檢查者。對(duì)照組為正常血壓受試者50人，男30人，女20人，平均年齡為（52.9±12.7）歲，常規(guī)檢查均無(wú)高血壓、糖尿病、高血脂、腎病等。入選者雙親均為壯族，對(duì)象之間無(wú)血緣關(guān)系，年齡、性別構(gòu)成與EH組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。

1.2研究方法

1.2.1血壓的測(cè)量方法受檢者均于早晨6：00～7：00進(jìn)行，取臥位，采用校正水銀血壓計(jì)，以Korotkoff法測(cè)量右上臂SBP、DBP，每次間隔5 min，連續(xù)測(cè)量3次，取平均值為血壓值，并測(cè)量身高和體重。

1.2.2生化指標(biāo)的檢測(cè)受檢者于采血前夜22：00后禁食，于早晨6：00～7：00抽取靜脈血約7 ml，其中2 ml用EDTA抗凝，置于4℃冰箱中，于3天內(nèi)提取DNA；5 ml置于促凝管，凝固后離心3000 r/min 20 min分裝血清，一部分直接送檢空腹血糖（FBG）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和尿酸（UA）等生化指標(biāo)，一部分置于-80℃冰箱中以備檢測(cè)TNFα血清水平。

1.2.3血清TNFα的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA），操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。使用美國(guó)BIORAD680酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔OD值，用專業(yè)軟件Curve Expert 1.3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，r=0.99987，根據(jù)樣本OD值計(jì)算出相應(yīng)的濃度，即為對(duì)應(yīng)樣本的血清濃度。

1.2.4基因組DNA的制備采用離心柱型提取血液基因組DNA，操作方法嚴(yán)格按照人血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。經(jīng)超微量分光光度計(jì)NanoVue檢測(cè)OD260/OD280比值均在1.6～1.9。分裝后放置-80℃冰箱備用。

1.2.5TNFα238G>A及TNFα863C>A多態(tài)性檢測(cè)PCR擴(kuò)增： PCR擴(kuò)增儀為BioRadPTC200，PCR試劑Premix Ex TaqTMVersion 2.0購(gòu)自日本TAKARA。引物（Primer）由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)及合成。TNFα238G>A上游引物（Forward Primer，F(xiàn)P）：AGCCCCTCCCAGTTCTAG，下游引物（Reverse Primer，RP）：TCTGTCTCGGTTTCTTCTCC。TNFα863C>A FP：AGCCCCTCCCAGTTCTAG，RP：AGCCCCTCCCAGTTCTAG。PCR總反應(yīng)體系為50 μl，其中 Premix Ex TaqTMVersion 2.0 25 μl，模板3 μl（濃度0.5～1.0 μg），滅菌蒸餾水20 μl，上下游引物各1 μl，樣品混合后置PCR儀30個(gè)循環(huán)。TNFα238G>A反應(yīng)條件：98℃變性10 s， 591 ℃退火 30 s，72 ℃延伸20 s；TNFα863C>A反應(yīng)條件：98 ℃變性10 s，62.6 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸19 s。TNFα238G>A擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為321 bp，TNFα863C>A擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為302 bp。反應(yīng)完成后取PCR產(chǎn)物5 μl用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠垂直電泳觀察PCR產(chǎn)物情況，電壓90 mV時(shí)間30 min，電泳液為0.5×TBE液，若相應(yīng)位置有清晰擴(kuò)增單一條帶，則純化后行測(cè)序反應(yīng)。

1.2.6PCR產(chǎn)物純化及測(cè)序使用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物條帶和濃度，對(duì)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行過(guò)膜純化或者切膠純化以及定量，采用sanger法進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序分析儀為3730XL測(cè)序分析儀，測(cè)序膠是POP7，均購(gòu)自美國(guó)AB公司。測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)雙峰， 則該位點(diǎn)為雜合子型， 出現(xiàn)單峰為純合子型。使用chromatogram file 軟件分析測(cè)序結(jié)果，采用直接基因計(jì)數(shù)法對(duì)基因型及等位基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

【摘要】目的探討腫瘤壞死因子α（TNFα）基因238G>A和863C>A多態(tài)性與廣西壯族原發(fā)性高血壓（EH）的相關(guān)性。方法采用ELISA法檢測(cè)152例廣西壯族EH患者（EH組）和50例廣西壯族健康者（對(duì)照組）血清TNFα、血脂、血糖（FBG）水平，用PCRSBT（PCR Sequencing Based Typing）方法檢測(cè)TNFα基因238G>A和863C>A多態(tài)性，探討血壓、血脂、FBG、TNFα水平與TNFα基因238G>A和863C>A的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果EH組收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、FBG、TNFα、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、體重指數(shù)（BMI）與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005或0.01 ）；與對(duì)照組比較，EH組TNFα863C>A GG基因型和等位基因頻率更高（P<0.05或0.01），TNFα238G>A AA基因型和等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。結(jié)論 廣西壯族原發(fā)性高血壓患者血清TNFα水平增高可能與TNFα238G>A有關(guān)聯(lián)，與863C>A基因多態(tài)性無(wú)明確關(guān)聯(lián)。

【關(guān)鍵詞】原發(fā)性高血壓； 腫瘤壞死因子α；基因多態(tài)性

中圖分類號(hào)：R544.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2014.04.001

原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）是導(dǎo)致腦卒中、冠心病、心功能不全、腎臟疾病等重要疾病的主要危險(xiǎn)因素之一[1]，近年來(lái)的研究表明，EH患者的患病率和病死率有逐年增高趨勢(shì)[2]。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心（CDC）的橫斷面研究表明[3]，2010年我國(guó)成年人高血壓患病率為33.5%，估計(jì)患病人數(shù)為3.3億，每年有45萬(wàn)人死于高血壓。EH的發(fā)病機(jī)制還在探索之中，目前認(rèn)為遺傳和環(huán)境因素的交互作用與EH的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[4]。研究表明，腫瘤壞死因子α（TNFα）基因啟動(dòng)區(qū)基因多態(tài)性與TNFα的轉(zhuǎn)錄和分泌相關(guān)[5～9]，為了解TNFα基因多態(tài)性與EH的關(guān)聯(lián)性，本文探討TNFα238G>A及TNFα863C>A多態(tài)性與廣西壯族EH的相關(guān)性。1對(duì)象與方法1.1研究對(duì)象EH組選擇雙親均為壯族的原發(fā)性高血壓患者152例（樣本來(lái)源于廣西百色地區(qū)）作為觀察對(duì)象，均簽署知情同意書(shū)，其中男93例，女59例，平均年齡為（55.9±13.7）歲。中國(guó)高血壓防治指南（2010年修訂本）診斷標(biāo)準(zhǔn)，EH為：收縮壓（SBP）≥140 mmHg和/或舒張壓（DBP）≥90 mmHg；或者既往有高血壓史，正在服用降壓藥者，雖血壓<140/90 mmHg，也可入選。排除繼發(fā)性高血壓、糖尿病、冠心病、自身免疫性疾病、腦梗死、心力衰竭、泌尿系統(tǒng)疾病、感染性疾病、腫瘤、嚴(yán)重的肝腎功能不全及應(yīng)用抗炎藥物、免疫抑制劑，不能耐受檢查者。對(duì)照組為正常血壓受試者50人，男30人，女20人，平均年齡為（52.9±12.7）歲，常規(guī)檢查均無(wú)高血壓、糖尿病、高血脂、腎病等。入選者雙親均為壯族，對(duì)象之間無(wú)血緣關(guān)系，年齡、性別構(gòu)成與EH組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。

1.2研究方法

1.2.1血壓的測(cè)量方法受檢者均于早晨6：00～7：00進(jìn)行，取臥位，采用校正水銀血壓計(jì)，以Korotkoff法測(cè)量右上臂SBP、DBP，每次間隔5 min，連續(xù)測(cè)量3次，取平均值為血壓值，并測(cè)量身高和體重。

1.2.2生化指標(biāo)的檢測(cè)受檢者于采血前夜22：00后禁食，于早晨6：00～7：00抽取靜脈血約7 ml，其中2 ml用EDTA抗凝，置于4℃冰箱中，于3天內(nèi)提取DNA；5 ml置于促凝管，凝固后離心3000 r/min 20 min分裝血清，一部分直接送檢空腹血糖（FBG）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和尿酸（UA）等生化指標(biāo)，一部分置于-80℃冰箱中以備檢測(cè)TNFα血清水平。

1.2.3血清TNFα的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA），操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。使用美國(guó)BIORAD680酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔OD值，用專業(yè)軟件Curve Expert 1.3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，r=0.99987，根據(jù)樣本OD值計(jì)算出相應(yīng)的濃度，即為對(duì)應(yīng)樣本的血清濃度。

1.2.4基因組DNA的制備采用離心柱型提取血液基因組DNA，操作方法嚴(yán)格按照人血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。經(jīng)超微量分光光度計(jì)NanoVue檢測(cè)OD260/OD280比值均在1.6～1.9。分裝后放置-80℃冰箱備用。

1.2.5TNFα238G>A及TNFα863C>A多態(tài)性檢測(cè)PCR擴(kuò)增： PCR擴(kuò)增儀為BioRadPTC200，PCR試劑Premix Ex TaqTMVersion 2.0購(gòu)自日本TAKARA。引物（Primer）由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)及合成。TNFα238G>A上游引物（Forward Primer，F(xiàn)P）：AGCCCCTCCCAGTTCTAG，下游引物（Reverse Primer，RP）：TCTGTCTCGGTTTCTTCTCC。TNFα863C>A FP：AGCCCCTCCCAGTTCTAG，RP：AGCCCCTCCCAGTTCTAG。PCR總反應(yīng)體系為50 μl，其中 Premix Ex TaqTMVersion 2.0 25 μl，模板3 μl（濃度0.5～1.0 μg），滅菌蒸餾水20 μl，上下游引物各1 μl，樣品混合后置PCR儀30個(gè)循環(huán)。TNFα238G>A反應(yīng)條件：98℃變性10 s， 591 ℃退火 30 s，72 ℃延伸20 s；TNFα863C>A反應(yīng)條件：98 ℃變性10 s，62.6 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸19 s。TNFα238G>A擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為321 bp，TNFα863C>A擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為302 bp。反應(yīng)完成后取PCR產(chǎn)物5 μl用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠垂直電泳觀察PCR產(chǎn)物情況，電壓90 mV時(shí)間30 min，電泳液為0.5×TBE液，若相應(yīng)位置有清晰擴(kuò)增單一條帶，則純化后行測(cè)序反應(yīng)。

1.2.6PCR產(chǎn)物純化及測(cè)序使用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物條帶和濃度，對(duì)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行過(guò)膜純化或者切膠純化以及定量，采用sanger法進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序分析儀為3730XL測(cè)序分析儀，測(cè)序膠是POP7，均購(gòu)自美國(guó)AB公司。測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)雙峰， 則該位點(diǎn)為雜合子型， 出現(xiàn)單峰為純合子型。使用chromatogram file 軟件分析測(cè)序結(jié)果，采用直接基因計(jì)數(shù)法對(duì)基因型及等位基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

【摘要】目的探討腫瘤壞死因子α（TNFα）基因238G>A和863C>A多態(tài)性與廣西壯族原發(fā)性高血壓（EH）的相關(guān)性。方法采用ELISA法檢測(cè)152例廣西壯族EH患者（EH組）和50例廣西壯族健康者（對(duì)照組）血清TNFα、血脂、血糖（FBG）水平，用PCRSBT（PCR Sequencing Based Typing）方法檢測(cè)TNFα基因238G>A和863C>A多態(tài)性，探討血壓、血脂、FBG、TNFα水平與TNFα基因238G>A和863C>A的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果EH組收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、FBG、TNFα、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、體重指數(shù)（BMI）與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005或0.01 ）；與對(duì)照組比較，EH組TNFα863C>A GG基因型和等位基因頻率更高（P<0.05或0.01），TNFα238G>A AA基因型和等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。結(jié)論 廣西壯族原發(fā)性高血壓患者血清TNFα水平增高可能與TNFα238G>A有關(guān)聯(lián)，與863C>A基因多態(tài)性無(wú)明確關(guān)聯(lián)。

【關(guān)鍵詞】原發(fā)性高血壓； 腫瘤壞死因子α；基因多態(tài)性

中圖分類號(hào)：R544.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2014.04.001

原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）是導(dǎo)致腦卒中、冠心病、心功能不全、腎臟疾病等重要疾病的主要危險(xiǎn)因素之一[1]，近年來(lái)的研究表明，EH患者的患病率和病死率有逐年增高趨勢(shì)[2]。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心（CDC）的橫斷面研究表明[3]，2010年我國(guó)成年人高血壓患病率為33.5%，估計(jì)患病人數(shù)為3.3億，每年有45萬(wàn)人死于高血壓。EH的發(fā)病機(jī)制還在探索之中，目前認(rèn)為遺傳和環(huán)境因素的交互作用與EH的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[4]。研究表明，腫瘤壞死因子α（TNFα）基因啟動(dòng)區(qū)基因多態(tài)性與TNFα的轉(zhuǎn)錄和分泌相關(guān)[5～9]，為了解TNFα基因多態(tài)性與EH的關(guān)聯(lián)性，本文探討TNFα238G>A及TNFα863C>A多態(tài)性與廣西壯族EH的相關(guān)性。1對(duì)象與方法1.1研究對(duì)象EH組選擇雙親均為壯族的原發(fā)性高血壓患者152例（樣本來(lái)源于廣西百色地區(qū)）作為觀察對(duì)象，均簽署知情同意書(shū)，其中男93例，女59例，平均年齡為（55.9±13.7）歲。中國(guó)高血壓防治指南（2010年修訂本）診斷標(biāo)準(zhǔn)，EH為：收縮壓（SBP）≥140 mmHg和/或舒張壓（DBP）≥90 mmHg；或者既往有高血壓史，正在服用降壓藥者，雖血壓<140/90 mmHg，也可入選。排除繼發(fā)性高血壓、糖尿病、冠心病、自身免疫性疾病、腦梗死、心力衰竭、泌尿系統(tǒng)疾病、感染性疾病、腫瘤、嚴(yán)重的肝腎功能不全及應(yīng)用抗炎藥物、免疫抑制劑，不能耐受檢查者。對(duì)照組為正常血壓受試者50人，男30人，女20人，平均年齡為（52.9±12.7）歲，常規(guī)檢查均無(wú)高血壓、糖尿病、高血脂、腎病等。入選者雙親均為壯族，對(duì)象之間無(wú)血緣關(guān)系，年齡、性別構(gòu)成與EH組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。

1.2研究方法

1.2.1血壓的測(cè)量方法受檢者均于早晨6：00～7：00進(jìn)行，取臥位，采用校正水銀血壓計(jì)，以Korotkoff法測(cè)量右上臂SBP、DBP，每次間隔5 min，連續(xù)測(cè)量3次，取平均值為血壓值，并測(cè)量身高和體重。

1.2.2生化指標(biāo)的檢測(cè)受檢者于采血前夜22：00后禁食，于早晨6：00～7：00抽取靜脈血約7 ml，其中2 ml用EDTA抗凝，置于4℃冰箱中，于3天內(nèi)提取DNA；5 ml置于促凝管，凝固后離心3000 r/min 20 min分裝血清，一部分直接送檢空腹血糖（FBG）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和尿酸（UA）等生化指標(biāo)，一部分置于-80℃冰箱中以備檢測(cè)TNFα血清水平。

1.2.3血清TNFα的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA），操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。使用美國(guó)BIORAD680酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔OD值，用專業(yè)軟件Curve Expert 1.3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，r=0.99987，根據(jù)樣本OD值計(jì)算出相應(yīng)的濃度，即為對(duì)應(yīng)樣本的血清濃度。

1.2.4基因組DNA的制備采用離心柱型提取血液基因組DNA，操作方法嚴(yán)格按照人血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。經(jīng)超微量分光光度計(jì)NanoVue檢測(cè)OD260/OD280比值均在1.6～1.9。分裝后放置-80℃冰箱備用。

1.2.5TNFα238G>A及TNFα863C>A多態(tài)性檢測(cè)PCR擴(kuò)增： PCR擴(kuò)增儀為BioRadPTC200，PCR試劑Premix Ex TaqTMVersion 2.0購(gòu)自日本TAKARA。引物（Primer）由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)及合成。TNFα238G>A上游引物（Forward Primer，F(xiàn)P）：AGCCCCTCCCAGTTCTAG，下游引物（Reverse Primer，RP）：TCTGTCTCGGTTTCTTCTCC。TNFα863C>A FP：AGCCCCTCCCAGTTCTAG，RP：AGCCCCTCCCAGTTCTAG。PCR總反應(yīng)體系為50 μl，其中 Premix Ex TaqTMVersion 2.0 25 μl，模板3 μl（濃度0.5～1.0 μg），滅菌蒸餾水20 μl，上下游引物各1 μl，樣品混合后置PCR儀30個(gè)循環(huán)。TNFα238G>A反應(yīng)條件：98℃變性10 s， 591 ℃退火 30 s，72 ℃延伸20 s；TNFα863C>A反應(yīng)條件：98 ℃變性10 s，62.6 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸19 s。TNFα238G>A擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為321 bp，TNFα863C>A擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為302 bp。反應(yīng)完成后取PCR產(chǎn)物5 μl用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠垂直電泳觀察PCR產(chǎn)物情況，電壓90 mV時(shí)間30 min，電泳液為0.5×TBE液，若相應(yīng)位置有清晰擴(kuò)增單一條帶，則純化后行測(cè)序反應(yīng)。

1.2.6PCR產(chǎn)物純化及測(cè)序使用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物條帶和濃度，對(duì)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行過(guò)膜純化或者切膠純化以及定量，采用sanger法進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序分析儀為3730XL測(cè)序分析儀，測(cè)序膠是POP7，均購(gòu)自美國(guó)AB公司。測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)雙峰， 則該位點(diǎn)為雜合子型， 出現(xiàn)單峰為純合子型。使用chromatogram file 軟件分析測(cè)序結(jié)果，采用直接基因計(jì)數(shù)法對(duì)基因型及等位基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。