鏈霉菌NG-715的抗真菌活性及穩(wěn)定性研究

袁敏，卞華，李晶，張雪鵬，程琳

（南陽理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河南 南陽 473004）

鏈霉菌NG-715的抗真菌活性及穩(wěn)定性研究

袁敏，卞華，李晶，張雪鵬，程琳

（南陽理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河南 南陽 473004）

目的研究鏈霉菌NG-715的抗真菌活性及穩(wěn)定性，建立其生物活性的檢測方法。方法以鏈霉菌NG-715所產(chǎn)抗真菌組分為材料，測試其對啤酒酵母、桔青霉、黑曲霉、黑根霉的最低抑制濃度和最低殺滅濃度。以黑曲霉為指示菌，測其生物檢測法和穩(wěn)定性。結(jié)果鏈霉菌NG-715所產(chǎn)抗真菌組分對啤酒酵母、桔青霉、黑曲霉、黑根霉的最低抑制濃度和最低殺滅濃度分別為 1．25、2．5、3．75、3．75 μg/mL和 2．5、10、17．5、17．5 μg/mL。生物檢測法求得抑菌圈直徑（mm）-濃度（μg/mL）的對數(shù)值之間的線性回歸方程為y=26．963 x-27．6，R2=0．9991。該抗真菌組分耐熱和酸堿，對紫外線較敏感。結(jié)論本研究為下一步對該抗真菌活性成分的分離提取提供了有益的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

鏈霉菌；抗真菌組分；最低抑制濃度；最低殺滅濃度；穩(wěn)定性

隨著抗藥性問題的日益嚴(yán)重，從環(huán)境中篩選新的抗生素仍是一個有效的方法，特別是在生防和醫(yī)藥上。鏈霉菌產(chǎn)抗菌物質(zhì)的研究國內(nèi)外已有許多報道[1-6]，鏈霉菌NG-715菌株是2008年7月15日從南陽理工學(xué)院東南校區(qū)張仲景國醫(yī)學(xué)院藥用植物園所采集的120份土樣中篩選得到的，前期研究結(jié)果顯示其發(fā)酵液能強(qiáng)效抑制多種革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌及真菌，有望開發(fā)成新型高效廣譜殺菌劑。為進(jìn)一步評價該菌株的抗真菌應(yīng)用潛力，筆者對其抗真菌活性和穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 經(jīng)HPLC制備分析后純度達(dá)到90%的抗真菌組分。

1.1.2 抑菌測定指示菌 啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、桔青霉（Penicillium citrinum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、黑根霉（Rhizopus sp.）以上菌種均由本校生物與化學(xué)工程學(xué)院提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 指示菌斜面、平板培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基[7]。

1.1.4 主要儀器 高壓蒸汽滅菌鍋（寧波開普YXQ-50 LS），無菌操作工作臺（蘇州華宏BCM-1000），全自動旋轉(zhuǎn)式搖床（上海天呈TS-100 B），生化恒溫培養(yǎng)箱（蘇州華宏SPX-250 F），電子天平（北京賽多利斯ALC-2100.2），722分光光度計（日本島津UV-2201）。

1.2 方法

1.2.1 指示菌菌懸液的制備[8]將供試的各指示菌斜面用無菌水洗下菌苔，倒入帶玻璃珠的30 mL無菌水三角瓶中，震蕩20 min后，用722分光光度計檢測650 nm波長處透光率，為20%時即成菌懸液。

1.2.2 生物活性的測定

①最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定[9]不同濃度抗生素藥液的配制：稱取抗真菌組分樣品4 mg，溶于6 mL無水乙醇，定容于50 mL容量瓶中，配制成80 μg/mL的溶液再將其稀釋至70 μg/mL、60 μg/mL、50 μg/mL、40 μg/mL、30 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL。將裝有1.5 mL液體培養(yǎng)基的系列試管高壓滅菌后，分別加入所稀釋的不同濃度的抗真菌組分溶液0.5 mL，然后分別取啤酒酵母、黑曲霉、黑根霉、桔青霉的菌懸液0.1 mL，于上述每列不同試管中加入1種真菌菌懸液，震蕩試管，使抗生素、菌懸液和培養(yǎng)基充分混勻。每種抗菌物質(zhì)留一列放冰箱中做為對照管，其余置30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h檢查結(jié)果。觀察含抗生素對照管與真菌對照管的情況，然后再觀察各試管中真菌生長情況，與抗生素稀釋液對照管比較。如加入真菌的試管仍為澄清，即表示無菌生長，則該管有抗菌作用；如為渾濁，即表示真菌已生長，無抗菌作用，以完全無菌生長的最低抗生素濃度為抗真菌組分的MIC。

②最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）的測定 與MIC測定相似，最低殺菌濃度（MBC）測定，也按上述試管稀釋，分裝于試管中，經(jīng)接種（啤酒酵母、黑曲霉、黑根霉、桔青霉）菌液后，置30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h。觀察抗真菌組分的最低抑菌濃度以上，未見真菌生長的各試驗(yàn)管培養(yǎng)物，分別吸取0.1 mL，移種至不含抗真菌組分的平皿瓊脂培養(yǎng)基上，用刮鏟涂勻，置30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h，觀察有無真菌生長。平皿培養(yǎng)基中的真菌計數(shù)少于5個菌落者為抗真菌組分的MBC。

③抗真菌組分標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[7]將80 μg/mL的抗真菌組分溶液分別稀釋至 70 μg/mL、60 μg/mL、50 μg/mL、40 μg/mL的溶液，在9 cm馬鈴薯葡萄糖瓊脂雙層平板上放置的牛津杯中滴加抗真菌組分的溶液，以黑曲霉為指示菌，進(jìn)行生物測定試驗(yàn)。測定抑菌圈，以抑菌圈直徑作縱坐標(biāo)，抗真菌組分溶液濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖。

1.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

①溫度穩(wěn)定性試驗(yàn) 將抗真菌組分溶液用無菌水稀釋后，分別在 30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴30 min。待自然冷卻后，用管碟法[6]測其生物活性。重復(fù)3次。

管碟法操作如下：取滅過菌的平皿，在皿底做好標(biāo)記。然后用大口移液管加入融化了的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基10 mL，放置水平臺上使之凝固作為底層。熔化馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，待冷卻至約50℃左右，以5%接種量接入黑曲霉菌懸液，旋轉(zhuǎn)搖勻后，用另一大口移液管吸取10 mL，使其攤布均勻作為上層。待其凝固后，用鑷子夾取無菌牛津杯，按預(yù)先標(biāo)記的位置放于上層培養(yǎng)基上，滴加樣品后，放置在30℃培養(yǎng)36 h后取出，用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑并記錄。

②pH穩(wěn)定性試驗(yàn) 取11份抗真菌組分溶液，每份1.5 mL，用不同的pH試液6.0 mL，將其調(diào)成pH 2～pH 12，然后將每份調(diào)好的樣品分裝成3支試管，這樣就得到了3組pH值為2-12的樣品。之后進(jìn)行如下處理：第一組樣品：25℃放置；第二組樣品：30℃水浴30 min；第三組樣品：30℃水浴60 min。將實(shí)驗(yàn)液用無菌水稀釋5倍作為CK，用管碟法測其生物活性。重復(fù)3次。

③紫外線穩(wěn)定性試驗(yàn) 將抗真菌組分溶液用無菌水稀釋5倍后放入滅過菌的平皿中，敞口放置在紫外線下分別照射0 min、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min、8 min、9 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min 處理后，用管碟法測其生物活性。重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 活性比率=樣品平均抑菌圈直徑/對照平均抑菌圈直徑×100%。

2 結(jié)果

2.1 生物活性的測定

2.1.1 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定結(jié)果 抗真菌組分對4種真菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定結(jié)果見表1。

表1 抗真菌組分對幾種真菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度（μg/mL）Tab.1 Analysis of MICs and MBCs of the antifungal substance against 4 fungi(μg/mL)

2.1.2 抗真菌組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 抗真菌組分樣品生物檢測結(jié)果見表2。根據(jù)表2的結(jié)果，以抑菌圈直徑為縱坐標(biāo)，抗真菌樣品濃度的對數(shù)值作橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y=26.963 x-27.6，R2=0.9991，說明生物活性測定法在抗真菌組分的質(zhì)量濃度為40 μg/mL～80 μg/mL范圍具有良好的線性。因此，可以采用該方法進(jìn)行抗真菌物質(zhì)含量的計算。

表2 抗真菌組分生物檢測結(jié)果Tab.2 The bioassay results of the antifungal substance

2.2 穩(wěn)定性的測定結(jié)果

2.2.1 溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 抗真菌組分的溫度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。從表3可以看出：抗真菌組分在30℃～100℃各種溫度水浴30 min條件下，與對照相比，其抑制黑曲霉的活性變化不大。這說明抗真菌組分對溫度穩(wěn)定，為以后進(jìn)一步分離提取提供了相關(guān)條件。

表3 抗真菌組分的溫度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The stability of the antifungal substance at different temperaturs

2.2.2 pH穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 抗真菌組分的pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。從表4可以看出：抗真菌組分溶液分別加入pH 2～pH 12的緩沖液，30℃水浴0min、30 min和60 min條件下，與對照相比，其抑制黑曲霉的活性變化不大，說明該組分耐酸堿。

2.2.3 紫外線穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 抗真菌組分的UV穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。從表5可以看出：抗真菌組分在紫外線照射下不穩(wěn)定。紫外線照射10 min后其抑菌活性為未照射時的88%；照射15 min后其抑菌活性大幅度下降為未照射時的64%；當(dāng)照射時間超過30 min時，其抑菌活性全部消失，極有可能已經(jīng)轉(zhuǎn)化成了別的物質(zhì)。

表4 抗真菌組分的pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 The Stability of the antifungal substance at different pH and Time

表5 抗真菌組分的UV穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5 The Stability of the antifungal substance at different pH and Time

3 討論

放線菌所產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)具有抗細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲和腫瘤等多種功能[10-13]。本研究以鏈霉菌NG-715所產(chǎn)生的抗真菌活性物質(zhì)為對象，測試其對啤酒酵母、桔青霉、黑曲霉、黑根霉的最低抑制濃度和最低殺滅濃度分別為1.25、2.5、3.75、3.75 μg/mL 和 2.5、10、17.5、17.5 μg/mL。周云等[14]對農(nóng)抗702抗真菌活性的測定結(jié)果中顯示農(nóng)抗702對啤酒酵母、桔青霉、黑曲霉、黑根霉的最低抑制濃度分別為6.5、6.5、3.3、3.3 μg/mL，在對啤酒酵母和桔青霉的抑制效果上，NG-715優(yōu)于農(nóng)抗702。趙華等[15]研究那他霉素的抑菌效果顯示其對啤酒酵母、桔青霉、黑曲霉、黑根霉的最低抑制濃度分別為2.75、2.75、5.5、5.5 μg/mL，在對啤酒酵母和桔青霉的抑制效果上，NG-715優(yōu)于那他霉素。

微生物發(fā)酵液中的有效化學(xué)成分的性質(zhì)一般是未知的，且量較少，因而分離提取過程中，常采用生物活性試驗(yàn)來跟蹤[16]。微生物檢測法求得線性回歸方程為y=26.963 x-27.6，R2=0.9991，說明生物活性測定法在鏈霉菌所產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的質(zhì)量濃度為40 μg/mL～80 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性，可以采用該方法進(jìn)行抗真菌物質(zhì)含量的計算，為下一步摸索其提取工藝時對該物質(zhì)的跟蹤檢測提供了依據(jù)。

鏈霉菌NG-715所產(chǎn)生的抗真菌活性組分耐熱和酸堿，而對紫外線較為敏感，在保存過程中要注意避光。李德舜等[17]研究結(jié)果顯示，山東鏈霉菌產(chǎn)的抗真菌物質(zhì)經(jīng)90℃處理 10 min，UV照射1 h和經(jīng)pH 1.0和pH 9.0處理后其抑菌活性都有明顯下降。周利娟等[18]從海洋鏈霉菌GB-2的發(fā)酵液中分離純化抗真菌物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)物質(zhì)在pH 1.0～pH 13.0，100℃和紫外照射24 h條件下抑菌活性幾乎不變?？梢娋瓴煌a(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性也有很大差異。本研究為下一步對該抗真菌活性組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定并探索其分離提取工藝提供了理論參考。

[1] 吳華偉，夏帆．S 15菌株的抗菌活性及抗菌物質(zhì)的特性[J]．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（18）：3722-3724．

[2] 暴增海，馬桂珍，王淑芳．一株海洋梅久蘭鏈霉菌的分離鑒定及其抗真菌作用研究[J]．食品科學(xué)，2012，33（19）：240-243．

[3] 張雯龍，付崗，潘連富，等．鏈霉菌S 417菌株發(fā)酵液的抗真菌活性及穩(wěn)定性研究[J]．西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，25（4）：1285-1287．

[4] 高芬，盧賽飛，王夢亮．鏈霉菌182-2抗真菌活性物質(zhì)的分離及抑菌特性的初步研究[J]．植物保護(hù)，2012，38（1）：71-75．

[5] Lee KH,Kim KW,Rhee KH．Identification of Streptomyces sp．KH 29,which produces an antibiotic substance processing an inhibitory activity against multidrug-resistant Acinetobacter baumannii[J]．Microbiol Biotechn ol,2010,20(12)：1672-1676．

[6] 李平，閏培生．一株新的海洋放線菌所產(chǎn)黃色素穩(wěn)定性研究及其16 S rDNA序列分析[J]．食品工業(yè)科技，2013，34（22）：275-279．

[7] 周德慶．微生物實(shí)驗(yàn)手冊[M]．上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社．1986：342-345．

[8] 袁敏，薛秀園，涂國全．鏈霉菌抗真菌組分所產(chǎn)抑真菌物質(zhì)理化性質(zhì)的初步研究[J]．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，27（4）：518-520．

[9] 張致平．微生物藥物學(xué)[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：388-392．

[10] 王博禪，陳桂琛，王啟蘭，等．一株抗腫瘤放線菌的鑒定及生物活性[J]．應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2012，18（6）：983-987．

[11] 陳力力，高必達(dá)，易圖永．鏈霉菌菌株 HNS 2-2的分類鑒定及其代謝產(chǎn)物抗煙草花葉病毒活性[J]．中國生物防治，2008，24（1）：69-74．

[12] 李利，張國強(qiáng)，韓立榮，等．內(nèi)蒙古地區(qū)土壤放線菌分離及其殺蟲活性研究[J]．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013（9）：184-187．

[13] 李萍，馬莉，奚家勤，等．放線菌 BJLSH9菌株兼抗線蟲及煙草疫霉菌的生防活性及其殺線蟲代謝產(chǎn)物鑒定[J]．云南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，34（5）；590-595．

[14] 周云，張智平，涂曉嶸，等．農(nóng)抗 702抗真菌活性的測定[J]．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，（6）：1127-1133．

[15] 趙華，何聰芬，蘭社益，等．天然防腐劑那他霉素的抑菌效果試驗(yàn)[J]．北京工商大學(xué)學(xué)報，2005，23（4）：13-15．

[16] 鄧松之．海洋天然產(chǎn)物的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007：1-34．

[17] 李德舜，蘇忠銳，袁志剛，等．山東鏈霉菌產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的理化性質(zhì)的初步研究[J]．山東大學(xué)學(xué)報 （理學(xué)版），2004，39（6）：12．

[18] 周利娟，焦陽，姚正穎，等．海洋鏈霉菌GB-2產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的分離純化和穩(wěn)定性研究[J]．中國海洋藥物雜志，2009，28（4）：35-39．

Bioactivity and stability study of the antifungal substance produced by Streptomyces NG-715

YUAN Min, BIAN Hua, LI Jing, ZHANG Xue-peng, CHENG Lin
(Medical Experimental Center, Nanyang Institute of Technology, Nanyang 473004, China)

ObjectiveTo explore the bioactivity and stability of the antifungal substance produced by Streptomyces NG-715 as well as to establish the assay for biological activity detection.MethodsTake the antifungal substance as experimental materials, and test its minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration on four fungi strains including Saccharomyces cerevisiae, Penicillium citrinum, Aspergillus niger, Rhizopus sp. Aspergillus niger was used as indicator strain to measure the biological activity and stability of the antifungal substance.ResultsThe results showed that the MIC of the antifungal substance on four fungi strains including Saccharomyces cerevisiae,Penicillium citrinum,Aspergillus niger,Rhizopus sp were 1.25, 2.5, 3.75 and 3.75 μg/mL, respectively. The MBC of the antifungal substance on four fungi strains were 2.5, 10, 17.5 and 17.5 μg/mL, respectively. Linearity regress equation of the antifungal substance in Aspergillus niger was y=26.963 x-27.6，R2=0.9991. The antifungal substance was pH-stable, heat-stable but ultravio1 et-sensible.ConclusionThe results from this study will porvide useful information for the further extraction and analysis on the bioactive compound。

Streptomyces; antifungal substance; minimum inhibitory concentration; minimum bactericidal concentration; stability

Q 936

A

1005-1678(2014)02-0037-03

南陽理工學(xué)院2009年度青年基金項(xiàng)目(NG 2009 QNJJ 10)

袁敏，女，碩士，講師，研究方向：抗生素提取，E-mail：ymin37@163.com。